detecção de potyviridae em espécies de

Detecção RESUMO
de Potyviridae EXPANDIDO
em espécies de Dieffenbachia.
DETECÇÃO DE POTYVIRIDAE EM ESPÉCIES DE DIEFFENBACHIA
E.B. Rivas1, S.R. Galleti1, L.M.L. Duarte1, M.A.V. Alexandre1*, A.Cilli1*, M.E.M. Estelita2
Instituto Biológico, Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Sanidade Vegetal, Av. Cons. Rodrigues Alves,
1252, CEP 04014-002, São Paulo, SP, Brasil. E-mail: [email protected]
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RESUMO
Em três amostras de Dieffenbachia (Araceae), planta cultivada como folhagem ornamental, foram
observadas ao microscópio eletrônico de transmissão partículas alongado-flexuosas. Como o DsMV
(Dasheen mosaic virus, Potyvirus) é o vírus mais comumente detectado em aráceas, foram realizados
testes serológicos com antissoros contra essa e outras espécies de Potyvirus. Paralelamente, foram
realizados ensaios moleculares com “primers” específicos para Potyviridae, observando-se padrões
eletroforéticos diferentes. A partir desses resultados, sugere-se a ocorrência de, pelo menos, duas
espécies distintas de Potyviridae, uma relacionada serologicamente ao DsMV (A75) e outras duas
não relacionadas (A67 e A69).
PALAVRAS-CHAVE: ELISA, RT-PCR, microscopia eletrônica de transmissão.
ABSTRACT
DETECTION OF POTYVIRIDAE IN DIEFFENBACHIA SPECIES. From three samples of the
ornamental foliage Dieffenbachia (Araceae), elongated, flexuous virus particles were observed by
way of electron microscopy. Since DsMV (Dasheen mosaic virus, Potyviridae) is the most common
virus affecting araceous plants, serological tests were performed against it and other potyviruses.
Simultaneously, molecular tests were made using specific primers for Potyviridae, resulting in
different eletrophoretic patterns. From such results it is suggested that at least two distinct
Potyviridae species were present in those samples. One of them (sample A75) is serologically related
and the remaining two (samples A67 and A69) unrelated to DsMV.
KEY WORDS: ELISA, RT-PCR, transmission electron microscopy
INTRODUÇÃO
A família Potyviridae, a qual possui membros
com partículas filamentosas com comprimento de
650-900 nm e genoma de RNA de fita simples e
senso positivo, compreende 106 espécies definitivas
e 90 prováveis espécies classificadas em 6 gêneros:
Potyvirus (maior gênero), Ipomovirus, Macluravirus,
Rymovirus, Tritimovirus e Bymovirus, que podem ser
distinguidos com base na organização do genoma,
no tipo de vetor responsável pela transmissão e na
susceptibilidade da hospedeira (Berger et al., 2000).
Essa família representa cerca de 30% de todos os vírus
que infectam plantas, os quais são cosmopolitas e,
do ponto de vista econômico, os mais importantes,
por infectarem mais de 2000 espécies em 550 gêneros
de dicotiledôneas e monocotiledôneas (Brunt et al.,
1997), abrangendo grande número de culturas de
regiões temperadas e tropicais (Shukla et al., 1994).
O objetivo deste trabalho foi detectar e identificar
os vírus presentes em amostras de aráceas ornamentais pertencentes ao gênero Dieffenbachia (Araceae).
MATERIAL E MÉTODOS
Material. Amostras de Dieffenbachia pertencentes
às espécies D. amoena, sob número de amostragem
A67e A75, e Dieffenbachia sp., número A69, apresentando manchas cloróticas acrescidas de anéis cloróticos concêntricos com contorno avermelhado, pontos
necróticos e faixas de nervuras, respectivamente. As
amostras foram coletadas em regiões produtoras do
Estado de São Paulo.
Microscopia eletrônica de transmissão. Fragmentos foliares das amostras foram triturados em
tampão fosfato de sódio e potássio (TF) 0,1 M, pH
7,0 e processados para contrastação negativa (Chrys-
Universidade de São Paulo, Instituto de Biociências, Departamento de Botânica, São Paulo, SP, Brasil.
*Bolsistas do CNPq.
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E.B. Rivas et al.
tie,
1996). Preparações semi-purificadas e antissoro
contra DsMV (Dasheen mosaic virus), diluído a 1/50,
foram utilizados em imunomicroscopia (Dijkstra &
De Jager, 1998).
Testes serológicos. Extratos de folhas infectadas
de Dieffenbachia, assim como de folhas sadias, foram
submetidos ao ELISA indireto, de acordo com Koenig
(1981), utilizando-se antissoros contra as espécies de
Potyvirus: BCMV (Bean common mosaic virus), BYMV
(Bean yellow mosaic virus), DsMV, TEV (Tobacco etch
virus) e PVY (Potato virus Y). Os extratos foliares
foram preparados na proporção de 1 g/5 mL de
tampão e os antissoros diluídos a 1/1000.
Transmissão mecânica. Fragmentos de folhas ou
de epiderme foliar foram triturados em TF 0,01 M pH
7,3 + 0,04 M de Na2SO3 e mecanicamente inoculados
em espécies das famílias: Aizoaceae, Amaranthaceae,
Araceae, Balsaminaceae, Chenopodiaceae, Cucurbitaceae e Solanaceae.
Semi-purificação. Folhas de Dieffenbachia de cada
uma das amostras foram pulverizadas com nitrogênio líquido, individualmente, homogeineizadas em
presença de TF 0,5 M pH 7,3 + 0,75% Na2SO3 + 0,01
M Na2EDTA e processadas de acordo com técnica
descrita por Abo El-Nil et al. (1977).
Extração do RNA viral. Fragmentos foliares das
amostras pulverizados em nitrogênio líquido e 250
μL de cada uma das preparações semi-purificadas
foram utilizados para a extração dos RNAs virais
com 750 μL de TRIzolTM, de acordo com recomendações do fabricante.
RT-PCR. A reação de transcrição reversa (cDNA)
e a posterior amplificação enzimática foram realizadas utilizando-se “primers” específicos para a ORF
da capa protéica viral de Potyviridae, utilizando as
condições descritas por Gibbs & MacKenzie (1997).
Como controle positivo para a reação utilizou-se
DsMV previamente caracterizado. Os produtos da
PCR (“amplicons”) foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 2% e os fragmentos de DNA
amplificados foram corados com brometo de etídeo
e visualizados sob luz ultravioleta.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Preparações de contrastação negativa revelaram a
presença de partículas alongado-flexuosas, em concentrações variáveis, em todas as amostras. Dados
de literatura mostram que o vírus mais frequentemente encontrado em aráceas cultivadas é o DsMV,
além do BYMV em Dieffenbachia (Mokrá & Götzová,
1994). Testes de imuno-microscopia (“decoração”)
realizados nas amostras revelaram ausência de reação
antígeno-anticorpo quando antissoro contra BYMV
foi utilizado. Quando antissoro contra DsMV foi empregado, observou-se reação positiva apenas para o
vírus da amostra A75 (Fig. 1). Já os testes realizados
com antissoros contra vírus distantemente relacionados ao DsMV, ou seja, BCMV e TEV (Zettler et al.,
1978; Brunt et al., 1997), e PVY foram negativos para
todas as amostras. Esses dados serológicos indicam
que havia, pelo menos, duas espécies distintas de
Potyviridae: uma serologicamente relacionada ao
DsMV (A75) e outra sem relacionamento serológico
com DsMV (A67 e A69).
Todas as amostras foram mecanicamente inoculadas em 22 espécies e cultivares de 7 famílias
botânicas, mas apenas o vírus da amostra A75 foi
mecanicamente transmitido. Esse vírus induziu, sistemicamente, áreas cloróticas em Caladium humboldtii
(Araceae), a única hospedeira experimental. Além
disso, os sintomas, tanto nas espécies naturalmente
infectadas como na hospedeira experimental, desapareciam dependendo das condições de temperatura e
fotoperíodo, deixando as plantas com aspecto sadio
por vários meses e, independente da presença de
sintomas, a concentração de vírus nessas plantas
apresentava-se extremamente baixa.
Como ocorre com muitas espécies da família
Potyviridae, o círculo de hospedeiros pode estar restrito a uma única família de monocotiledônea, como nos
gêneros Bymovirus, Potyvirus (por exemplo, DsMV
da amostra A75), Rymovirus e Tritimovirus (Shukla
et al., 1994; Berger et al., 2000). Assim, dentre os seis
gêneros que compõem a família Potyviridae pode-se,
com base no círculo de hospedeiros, descartar a possibilidade das amostras A67 e A69 estarem infectadas
por Bymovirus, Rymovirus e Tritimovirus, pelo fato
desses gêneros infectarem apenas gramíneas (Berger
et al., 2000). Desse modo, sugere-se que as espécies de
Potyviridae das amostras estudadas devam pertencer
ao gênero Potyvirus ou, menos provavelmente, aos
gêneros Ipomovirus e Macluravirus. Convém destacar
que dentre as culturas de importância econômica,
que possuem como fator de restrição a sua comercialização, infecções por Potyvirus, está a de plantas
ornamentais como Dieffenbachia (Cohen, 1995).
RT-PCR realizadas a partir de RNAs extraídos
de fragmentos foliares infectados não resultaram em
produtos detectáveis, talvez devido à presença de
metabólitos secundários presentes na preparação.
Quando a RT-PCR foi realizada com RNAs extraídos
de preparações semipurificadas, produtos de diferentes
tamanhos foram obtidos (Fig. 2). Analisando-se os produtos das 3 amostras, em gel de agarose, verificaram-se
diferentes padrões eletroforéticos, indicando assim
uma diversidade genômica, ou seja, a presença de mais
de uma espécie de Potyviridae. Matthews et al. (1996)
utilizando um par de “primers”, diferente do usado
neste trabalho, observaram que TFMoV (Taro feathery
mottle virus, Potyvirus) possuía um produto de PCR
com padrão eletroforético diferente de DsMV, o qual
eles atribuíram a uma diversidade genômica entre eles.
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Detecção de Potyviridae em espécies de Dieffenbachia.
Fig. 1 – A- “Decoração” de partícula alongado-flexuosa,
presente em A75, com antissoro contra DsMV. B- Partícula
alongado-flexuosa não “decorada” com antissoro contra
DsMV, presente em A67. Barras = 150 nm.
CONCLUSÃO
Neste trabalho foi constatada a infecção por vírus
da família Potyviridae em espécies de Dieffenbachia por
meio de ensaios de transmissibilidade, observação de
partículas alongado-flexuosas, imuno-microscopia
e RT-PCR. Análise de dados moleculares mostrou
tratar-se de espécies distintas de Potyviridae, tendo
uma delas (A75) relacionamento serológico e padrão
eletroforético dos “amplicons” semelhante ao DsMV.
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Fig. 2 – Eletroforese em gel de agarose 2% dos “amplicons”
obtidos a partir das amostras (1) A67, (2) A75, (3) A69; (4)
controle positivo: DsMV; (M) marcador de peso molecular
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