1 PERFIL PLASMIDIAL DE COLIFORMES FECAIS EM

Anais do IX Seminário de Iniciação Científica, VI Jornada de Pesquisa e Pós-Graduação
e Semana Nacional de Ciência e Tecnologia
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS
19 a 21 de outubro de 2011
PERFIL PLASMIDIAL DE COLIFORMES FECAIS EM BEBEDOUROS DE
ESCOLAS PÚBLICAS.
Denize Gomes de Freitas ² ( UEG – UnU Morrinhos – GO)
Lilian Carla Carneiro
[email protected]
Introdução
A OMS (Organização Mundial da Saúde) dispõe que várias doenças que ocorrem em países
podem ser vinculadas por microrganismos patogênicos encontrados na água contaminada
(COELHO, D. A. et. al , 2007).A água como é uma fonte de vida pode colocar em risco a
saúde pública, pela possibilidade de estar contaminada com coliformes (GELDREICH, 1974).
A atividade humana faz gerar contaminações na água e esses coliformes que podem ser
encontrados são de grandes discussões devido à possibilidade de serem indicadores de
patógenos entéricos (OLIVEIRA e TERRA, 2004) As bactérias coliformes são de fácil
cultivo e geralmente podem ser bons indicadores de poluição fecal, sendo este grupo de
bactérias representando principalmente pela Escherichia coli, Salmonella sp e Klebsiella sp..
Porém, nem todos os coliformes são de origem fecal, pois contem no solo e também de
vegetais (NASCIMENTO e FURLANETTO, 1981).A Escherichia coli é responsável por
grandes surtos de toxinfecção alimentar devido a insatisfatória higiene-sanitária, como na
falha de higienização das mãos, sendo assim um indicador de contaminação fecal, pois estará
contaminando o alimento a ser ingerido (OLIVEIRA et al., 2003 ).
A Salmonella ocorre normalmente em animais podendo estar presente nos seres humanos e
ser patogênica para humanos (CORTEZ, L. A.L. et al, 2004). A salmonelose vem sendo uma
das principais doenças causadas pelo gênero Salmonella sp. podendo ser transmitido por
alimentos (CASTAGMA, S.M.F. et al., 2004).O gênero Klebsiella faz parte da família
Enterobacteriaceae , são isoladas de materiais biológicos humanos e é uma bactéria com
grande relevância pois apresenta infecção hospitalar na condição de oportunista e infecções
em pacientes imunocomprometidos.(MARTINEZ, M. B. & TRABULSI, L. R., 2008)As
bactérias que conferem algum tipo de resistência a antibióticos podem estar ligadas aos
plasmídeos celulares.
A presença de plasmídeo em apenas alguns tipos de Salmonella sp levanta uma questão sobre
a função biológica dos mesmos (RYCHLIK, et al., 2005). Plasmídeo é um material genético
extracromossomal com capacidade de replicar independentemente por ter origem de
replicação (Oric) independente do DNA cromossomal. O Plasmideo é formado por uma
molécula de DNA fita dupla circular podendo variar de 1 a 200 kb (ZAHA, 1996). Sabendo
que as bactérias possuem mecanismos de defesa para resistir as pressões seletivas, este
trabalho tem o objetivo de avaliar a presença de plasmídeo nas bactérias que foram isoladas
das amostras de água e da superfície do bebedouro de escolas públicas, verificar resistência
bacteriana aos antibióticos ampicilina, tetraciclina e ciprofloxacino, analisar a estabilidade
plasmidial e observar a conjugação bacteriana.
Materiais e Métodos
Local de Coleta e cultivo dos microorganismos.
As amostras de bactérias utilizadas nesse trabalho foram isoladas da água e da
superfície de bebedouros de escolas públicas da cidade de Morrinhos - GO. Foram coletadas
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amostra de água com alíquota de 10 mL em cada escola visitada. As amostras foram
cultivadas em ágar nutriente, e para as superfícies dos bebedouros foram coletadas amostras
através de swabs que posteriormente foram imersos em ágar nutriente. As amostras coletadas
foram deixadas na estufa de cultura por 24 horas para o crescimento bacteriano, após este
período foram mantidas á temperatura de 4ºC, sendo repicados mensalmente.
Identificação bacteriana
Foram isoladas amostras bacterianas de 51 bebedouros. As bactérias foram identificadas
através de testes bioquímicos: glicose, lactose e citrato de simons, como também os meios EC
(Escherichia Coli) e ágar SS (Salmonella sp. e Shigella sp.) para a identificação das bactérias
E. Coli, Salmonella sp. e Klebsiella sp. definidas como coliformes fecais, tais amostras foram
conduzidas para a análise da presença de plasmídeos.
Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos
O antibiograma foi realizado através da metodologia por disco de difusão de Bauer & Kirby,
segundo os critérios estabelecidos pelo National Committee for Clinical Laboratory Standards
(NCCLS, 2003). A inoculação foi distribuída através de varredura utilizando swab na
superfície do ágar Müeller-Hinton, em seguida foram colocados os discos de antibióticos
(ampicilina 10µg, tetraciclina 30µg e ciprofloxacina 5µg) no ágar, com o auxílio de uma pinça
estéril. Após a aposição dos discos, as placas foram invertidas e incubadas a 36ºC por 18 a 24
horas, posteriormente as placas foram analisadas através dos halos de inibição.
Extração de DNA plasmidial
Baseado no manual do kit de extração FLEXIPREP da Pharmacia, as amostras bacterianas
foram inoculadas em 5mL de meio L (meio Luria) e incubadas à 37ºC overnight sob agitação
de 150 rpm. Uma alíquota de 1,5mL foi centrifugada a 5.000xg em tubos tipo Eppendorf por
30 segundos, o processo foi repetido três vezes.Os sedimentos foram ressuspensos em 200 µL
de solução I, homogenizado e adicionados 200 µL de solução II. O material foi misturado por
inversão do tubo durante 5 minutos e adicionados 200 µL de solução III, homogenizando
suavemente por inversão durante 5 minutos e centrifugado a 5.000 xg por 5 minutos (segundo
instruções do fabricante). O sedimento, correspondente ao DNA cromossomal foi descartado
e o sobrenadante, contendo o DNA plasmidial foi transferido para outro tubo. O DNA foi
precipitado pela adição de 420 µL de isopropanol e após homogenizado no vortex e colocado
em repouso por 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida foi centrifugado por 10
minutos a 5.000 xg, sendo o sobrenadante desprezado e o precipitado deixado secar à
temperatura ambiente. O precipitado foi ressuspenso em 50 µL de água destilada estéril,
visualizado em gel de agarose 1% (p/v) corado com brometo de etídio e analisado por
eletroforese.
Eletroforese em gel de agarose
De acordo com Sambrook et al., (1989) as amostras de DNA plasmidial foram analisadas em
gel de agarose. O DNA plasmidial foi avaliado em gel de agarose 1% (p/v) corado com
brometo de etídeo, dissolvida em TEB 0,5X e brometo de etídio (0,2 µg/mL). Foi submetido o
gel a uma amperagem de 30 mA até que a amostra entrasse no poço, sendo posteriormente
ajustada para 60 mA. Visualizou-se as bandas de DNA plasmidial por irradiação ultravioleta
de baixa intensidade. Foi utilizado um marcador de peso molecular de 1 kb DNA ladder da
promega.
Estabilidade Plasmidial
Baseado no método de Summers & Sherratt (1984), foram inoculadas células isoladas
contendo os plasmídeos crípticos obtidos das bactérias isoladas de bebedouro em meio
nutriente, suplementado com antibiótico ampicilina onde as bactérias foram testadas e
incubadas à 37ºC overnight; 5 µl dessa cultura foram transferidas para 5 mL de meio nutriente
sem antibiótico e alíquotas foram plaqueadas em meio nutriente 1,0% (p/v), suplementado
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com antibiótico ampicilina e plaqueadas sem o antibiótico. O restante da cultura foi mantida a
37ºC por 24 horas, sob agitação de 150 rpm. Esse procedimento foi repetido durante quatro
dias, com inoculações e plaqueamentos realizados a cada 24 horas.
Conjugação
A conjugação da amostra doadora com a receptora seguiu a metodologia descrita por
Mitsuhashi et al., (1960), com modificações. A amostra doadora (Coliformes contendo os
plasmídeos crípticos) e as receptoras com características lac Z negativas (DH5α), foram
cultivadas separadamente em meio L. Após 18 horas, foram misturados os dois caldos de
cultura, reincubados os cultivos bacterianos por 24 horas e selecionados os transconjugantes
plaqueando em meio LA contendo ampicilina o cromógeno X-Gal. Após crescimento,
observamos o aparecimento das colônias azuis e brancas.
Resultado e discussão
As amostras coletadas totalizaram 110, sendo 102 das superfícies dos bebedouros das escolas
e oito amostras de água, sendo que 21 dessas (três da água, oito do botão que ao pressionar
controla a saída de água, e 10 do cano maior do bebedouro) não apresentaram nenhum tipo de
contaminação. Dentre as 89 amostras positivas, 49,44% apresentaram contaminações por
coliformes e as outras 50,56% das amostras apresentaram positividade para outros tipos de
microrganismos. Das oito amostras de água, três delas não foi constatado contaminação,
porém, das que apresentaram contaminação, nenhuma deram positiva para os coliformes
fecais, diferindo do trabalho de Dantas et al. (2010) que apresentaram todas as amostras
contaminadas por bactérias aeróbicas totais e nenhuma contaminação por coliformes totais,
obtendo resultado positivo dentre as normas da legislação brasileira. Dados semelhantes para
análise da água foram encontrados também por Silva & Pires (2009), que não obtiveram
contaminação por Escherichia coli em nenhuma amostra. Em conclusão ao trabalho de Silva
et al. (2010) sobre a avaliação da condição sanitária da água de bebedouros públicos,
percebeu que a contaminação nem sempre está relacionada com a superfície do bebedouro
contaminado, concordando com este trabalho que nem todos os bebedouros que apresentaram
contaminação de bactéria na superfície, tiveram suas amostras de água contaminadas.
A avaliação de susceptibilidade foi realizada em todas amostras sendo que 85% delas foram
sensíveis aos antibióticos (Ampicilina, tetraciclina e Ciprofloxacina), 6,4% estavam
classificados em intermediário e 8,6% foram resistentes. Através do isolamento das cepas de
Salmonella spp. da água coletada dos Rios Acaraú e Jaguaribe, verificou que o antibiótico
tetraciclina apresentou maior número de resistência e mostrou sensibilidade ao antibiótico
ciprofloxacino (FIGUEREDO et al., 2008). Nos estudos de Depizzol et. al (2006) no qual
isolou E. coli do esgoto sanitário, encontraram altos índices de resistências aos antibióticos
tetraciclina, amoxilina, eritromicina e penicilina, mas não houve resistência à neomicina,
gentamicina, ciprofloxacino e ceftriaxone. Algumas amostras apresentaram plasmídeo com
tamanho molecular entre 8 a 10 kb. As demais amostras que apresentaram plasmídeos não
conferiram resistência à antibióticos; as amostras que apresentaram resistência a antibiótico e
não foi observado plasmídeo, pode-se sugerir que estão correlacionadas a genes
cromossomais.
Conforme os estudo de Araújo et. al (2009) que analisaram o perfil plasmidial em bactérias
presentes no ribeirão paciência - MG, todas as bactérias que tiveram resistência ao antibiótico
ampicilina apresentaram plasmídeo e as bactérias resistentes a tetraciclina e eritromicina não
foi observado DNA plasmidial, sugerindo também, como o presente estudo, uma relação de
resistência com genes cromossomais. Segundo trabalho de Gonçalves et. al (2004) obtiveram
10 amostras de Vibrio sp. que exibiram de dois a três plasmídeos com pesos moleculares
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variando entre 5,5 a 40 kilobases. Testes identificaram que todos os plasmídeos foram
estáveis e apresentaram conjugação bacteriana eficiente. Hofer et. al (1999) selecionaram
7058 cepas de Vibrio cholerae e encontraram plasmídeos estáveis. A estabilidade foi
comprovada durante cinco anos de manuseio das amostras, sem que elas perdessem o fator de
resistência. Conforme os estudos de Paula et. al (2003) que analisaram o perfil plasmidial de
Fusobacterium nuclatum isolados da mucosa oral de humanos e Cebus apella isolada em
primatas, encontraram um perfil plasmidial similar e estável entre as cepas bacterianas.
Conforme Vicente et al. (1988) ao avaliarem a presença e a transferência de plasmídeo em
coliformes fecais em água de esgoto, obtiveram resultados positivos de conjugação.
Conclusão
Com todas as informações analisadas podemos concluir que onze amostras foram positivas
para E. coli, 28 para Salmonella sp, seis para Klebsiella sp e 44 foram positivas para outros
coliformes não identificados. As bactérias identificadas como E. coli, Salmonella sp e
Klebsiella sp. apresentaram plasmídeos, contabilizando três amostras de E. coli; sete de
Salmonella sp e uma amostra de Klebsiella sp. Das 44 amostras classificadas como alguns
tipos de coliformes, 16 apresentaram plasmídeo.
Os plasmídeos presentes tiveram um perfil plasmidial semelhantes com peso molecular entre
8 e 10 Kb, podendo ou não conferir resistência à antibiótico. As amostras com resistência à
antibiótico e não possuem plasmídeo, sugere que estas relações podem estar ligadas a gene a
níveis cromossomais. Contudo, teste de estabilidade plasmidial mostra que todas as amostras
são estáveis e puderam se transconjugarem para outra célula bacteriana E. coli da linhagem
DH5α.
Referência Bibliográfica
VICENTE, A.C.P.; DIAS, J.C.A.R.;HOFER,E. Coliformes fecais em água de
esgoto.II.tranferência de marcadores e presença de plasmídeo. Instituto Oswaldo
Cruz,Departamento de Bacteriologia. v. 83: 29-35p., 1988.
HOFER, E. et. al Emergência da múltipla resistência a antimicrobianos em Vibrio cholerae
isolados de pacientes com gastroenterite no Ceará, Brasil. Revista da Sociedade Brasileira
de Medicina Tropical, 32(2):151-156, 1999.
PAULA, M. O. et al. Plasmid profile in oral Fusobacterium nucleatum from humans and
Cebus apella monkeys. Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo, 45(1):5-9, 2003.
GONÇALVEZ, E. G. R.;HOFER,E ; LEAL, N. C. Estudo Molecular de Vibrio cholerae nãoO1 isolado de zooplâncton da Baía de São Marcos/São Luis – MA, Brasil. Revista da
Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 37(4):324-328, 2004.
ARAUJO, J. G. et. al . Perfil de Dna plasmidial em bactérias resistentes a antibióticos
isoladas do ribeirão paciência- Pará de Minas- MG. SynThesis Revista Digital FAPAM,
Pará de Minas, n.1, 2009.
DEPIZZOL, F & CASSINI, S. T. A. Avaliação da resistência a antibiótico em isolados de
Escherichia coli provenientes de esgoto hospitalas e sanitário. Biblioteca Central da
Universidade Federal do Espírito Santo, ES, Brasil. 2006.
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Anais do IX Seminário de Iniciação Científica, VI Jornada de Pesquisa e Pós-Graduação
e Semana Nacional de Ciência e Tecnologia
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS
19 a 21 de outubro de 2011
FIGUEIRÊDO, F. V. et. al . Susceptibilidade a antimicrobianos e resistência plasmidial de
cepas de Salmonella spp isoladas de dois estuários do estado do Ceará – BRASIL. Serviço
Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Campus de Jaboticabal. SÃO PAULO,
2008.
SILVA, A.C.A.et. al.Avaliação da condição sanitária da água de bebedouros públicos. In:
XIV Encontro Latino Americano de Iniciação Científica e X Encontro Latino Americano de
Pós-Graduação; 2010. Anais do Encontro Latino Americano de Iniciação Científica.
Universidade do Vale do Paraíba, 2010. p. 1- 5 .
SILVA, M. S. & PIRES, L. B. Avaliação da qualidade microbiológica da água dos
bebedouros do bosque Guarani em Foz do Iguaçu/PR. Fac. Din. das Cataratas. Foz do
Iguaçu, 2009. Disponível em: < http://www.udc.edu.br/monografia/monoamb84.pdf >.
Acesso em: 10 agosto. 2011.
DANTAS, A. K. D.et al, Qualidade microbiológica da água de bebedouros destinada ao
consumo humano. Revista biociências, Unitau. V.16,Nº 2, 2010.
National Committee for Clinical Laboratory Standards. Methods for dilution antimicrobial
susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Documents M7-A6 and M100-813.
Wayne, Pa, USA, 2003.
SAMBROOK, P.H.; FRITSH,E.F. & MANIATS,T. Molecular Cloning. 1989- A laboratory
Manual. 2 ED. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
SUMMER, D. K. & SHERRAT, D. J. 1984. Multimerization of high cop Y number plasmids
causes instability: E col1 encondes a determinant essential for plasmid monomerization and
stability. Cell.36: 1097- 1103.
ZAHA, A. Biologia Molecular Básica. Porto Alegre, Mercado Aberto. 1996, Cap 3, pg. 70.
RYCHLIK,I .; GREGOROVA,D ; HRADECKA,H. Distribution and function of plasmids in
Salmonella enterica. Veterinary Research Institute. v.112: 1-10, 2006.
COELHO, D. A.; SILVA, P. M. F.; VEIGA, S. M. O. M.; FIORINI, J. E. Avaliação da
qualidade microbiológica de águas minerais comercializadas em supermercados da cidade de
Alfenas, MG. Revista Higiene Alimentar, São Paulo, v. 21, n. 151, p. 88-92, maio 2007.
GELDREICH, E. E. Aspectos microbiológicos dos esgotos e dos seu processos de tratamento
IN: campanha estadual de tecnologia de saneamento básico e de controle de poluição das
águas. Desinfecção de águas. São paulo .p. 115- 134, 1974.
OLIVEIRA, A. C. S. & TERRA, A. P. S. Avaliação microbiológica das águas dos bebedouros
do Campus I da Faculdade de Medicina do Triângulo Mineiro, em relação a presença de
coliformes totais e fecais. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, Rio de
Janeiro, v.37, n.3, p.285-86, 2004.
NASCIMENTO,D. & FURLAMENTO,S.M.P. Determinação quantitativa de grupos de
bactérias em suco de laranja ao natural. Revista Saúde Pública. v.5 : 221-235, 1981.
TRABULSI, L. R. & ALTERTHUM, F. , Microbiologia. In: MARTINEZ, M. B. &
TRABULSI, L. R. (Org.). Enterobacteriaceae. São Paulo: Atheneu, 2008. p.271-275.
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