-MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO E DESINFECÇÃO

-MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO
E DESINFECÇÃO
- CINÉTICA DE MORTE MICROBIANA
Definição de termos
 Esterilização: destruição ou eliminação total dos
microorganismos.
 Sanitização: procedimento que envolve diferentes
processos, visando obter o grau de higiene e limpeza
adequados.
 Desinfecção:
processo
para
eliminar
os
microorganismos
patogênicos,
sem
necessariamente eliminar, todas as bactérias e
esporos.
Definição de termos
 Anti-sepsia: desinfecção da pele, mucosas ou
tecidos.
 Agentes biocidas: morte dos microrganismos.
 Agentes biostáticos: inibição do crescimento.
- Métodos de esterilização e desinfecção Fatores que influenciam o crescimento microbiano
• Temperatura
• Tipo de microrganismo
• Fase de crescimento
• Ambiente
Resistência de microrganismos aos
métodos de esterilização e desinfecção
Maior resistência
-Prions
- endosporos de bactérias
- mycobacterias
- Gram negativos
- Fungos
- Vírus (sem envelope)
- Gram positivos
- Vírus com envelope lipídico
Menor resistência
MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO
- Significa a completa destruição de todos os
organismos vivos e seus esporos ou sua completa
remoção da preparação.
- Processos físicos: métodos térmicos
1. Calor úmido (Vapor);
2. Calor seco;
- Processos físicos: métodos não-térmicos
3. Filtração;
4. Radiação ionizante.
- Processos químicos:
5. Esterilização por GASES.
- Métodos de esterilização e desinfecção –
Modos de ação
 Lesão dos ácidos nucleicos
Desnaturação das proteínas
Inibição do metabolismo
Ruptura da membrana celular
CALOR ÚMIDO OU VAPOR (método físico)
- Feita em autoclaves e emprega vapor sob pressão.
- Método escolhido na maioria dos casos em que o
produto é capaz de resistir a tal tratamento.
- Mais rápido que calor seco (pois quando há presença de
água, as bactérias são coaguladas e destruídas em Tº’s
mais baixas - desnaturação de proteína e quebra das
pontes de H – cinética morte microbiana)
10 libras de pressão (115ºC, por 30’) (não inativa endosporos
e alguns vírus)
15 libras de pressão (121ºC, por 20’)
20 libras de pressão (125ºC, por 15’)
Quanto > pressão, mais elevada a Tº e < tempo de esterilização
VAPOR (método físico)
Útil para esterilizar: soluções farmacêuticas
em geral, frascos de vidro, compressas e
instrumentos cirúrgicos.
Não serve para esterilizar: preparações
oleosas ou outras que não sejam penetradas
por umidade e pós.
Monitoramento do ciclo
Esterilização a vapor
• Mecânicos – registros tempo, T°C e pressão.
• Químicos – fita teste e Teste Bowie-Dick.
• Biológicos – Ampolas contendo esporos de Bacilos
Stearothermophilus.
Indicadores Químicos
Classe 1: Tiras impregnadas com tinta termo-química
que muda de coloração quando exposto a
temperatura.
 usados externamente em todos os
pacotes
 evidenciam a passagem do material
pelo processo
Classe 2:
Teste de BOWIE & DICK - testa a eficácia do sistema de
vácuo da autoclave pré-vácuo.
 verifica a eficiência da bomba de vácuo
 espera-se mudança uniforme da cor do papel, em toda sua extensão
 recomenda-se que seja feito no primeiro ciclo do dia ou pelo menos a
cada 24 horas
 caso não haja homogeneidade na revelação, efetuar revisão imediata do
equipamento
Teste OK
Falha no teste
VALIDAÇÃO DA ESTERILIZAÇÃO A
VAPOR
- Usa-se um indicador biológico (preparação constituída
de microrganismos específicos e resistentes
a
determinado processo de esterilização).
- Bacillus stearothermophilus (120ºC)
- Bacillus subtilis (110ºC)
Indicadores Biológicos
- São preparações padronizadas de microorganismos,
numa concentração do inócuo em torno de 106,
comprovadamente resistentes e específicos para um
particular processo de esterilização para demonstrar
a efetividade do processo.
• Primeira geração: tiras de papel com esporos
microbianos,
incubados
em
laboratório
microbiologia com leitura em 2-7 dias.
de
Segunda geração: auto-contidos
com leitura em 24 a 48 horas.
Terceira geração: auto-contidos
com leitura em 1 a 3 horas.
CALOR SECO (método físico)
- Utiliza-se estufa;
-Tempos de exposição e temperatura: variam conforme o
tipo de material a ser esterilizado;
Temperatura
171o.C
160o.C
149o.C
141o.C
121o.C
Tempo
60 minutos
120 minutos
150 minutos
180 minutos
16horas
- Morte microorganismo, ocorre por desidratação celular
(OXIDAÇÃO);
- O maior problema relacionado é o fato de que a
penetração do calor é difícil, lenta e distribui-se de forma
heterogênea.
CALOR SECO (método físico)
ÚTIL PARA ESTERILIZAR: ÓLEOS FIXOS,
GLICERINA, DERIVADOS DE PETRÓLEO –
VASELINA E PARAFINA, DIVERSOS PÓS
ESTAVEIS AO CALOR (ÓXIDO ZINCO),
ARTIGOS DE VIDRO E INSTRUMENTOS
CIRÚRGICOS.
FILTRAÇÃO (método físico)
-Remoção física de microrganismos por adsorção sobre
um meio filtrante;
- Usa-se este método quando as soluções são
termossensíveis;
- Existem, comercialmente, vários tipos de filtros com
especificações variadas quanto ao tamanho dos poros.
(ex. Millipore – 0,22 a 0,45µm);
-As membranas filtrantes permitem a filtração de grandes
volumes de produto, mantendo sua característica e
obtenção de um produto estéril.
- filtros HEPA – filtração do ar (qualidade do ar de salas
limpas).
- Vantagens: quando o aquecimento não pode ser
aplicado e para pequenos volumes líquidos.
-Desvantagem: membranas são frágeis (observar se
houve rompimento) e tempo de filtração quando
soluções viscosas.
VALIDAÇÃO DE ESTERILIZAÇÃO POR FILTRAÇÃO:
- Via teste destrutivo: retenção bacteriológica
(concentração de 107
UFC de Brevundimonas
diminuta ATCC19146 por centímetro quadrado de área
filtrante).
- Via teste não destrutivo: integridade da membrana
(teste de Ponto de bolha e Fluxo Difusivo).
-Teste de Integridade
- Basicamente
os filtros são hidrofílico (líquido
molhante=água),
- e hidrofóbico(líquido molhante=álcool isopropílico
60% + água 40%)
- São realizados testes iniciais e finais antes e depois
de cada processo de filtração.
-Teste de Ponto de bolha: O teste de Ponto de Bolha
consiste em se molhar o filtro com líquido conveniente
e aplicar uma pressão de gás (ar comprimido ou N2)
suficiente para expulsar o líquido de dentro dos
maiores poros da membrana. Ao atingir esta pressão,
o gás que está pressurizando a membrana molhada
consegue atravessá-la e pode ser visualizado na saída
do filtrado.
Teste de Fluxo Difusivo: O teste de Difusão mede a vazão
de gás que passa por difusão através do líquido que está
dentro dos poros da membrana molhada, isto é, sem
expulsar o líquido dos poros. O teste é realizado com
pressão constante e temperatura controlada. A vazão de
difusão deve ser menor que o valor definido pelo
fabricante do filtro, que também deve comprovar a
correlação do valor máximo de difusão com a retenção de
microorganismos, para garantir um grau de retenção
esterilizante para cada lote de fabricação.
Obs. B. diminuta é escolhida devido à sua característica
de crescimento mantendo células isoladas, de dimensão
(0,3 a 0,6µm), fácil manutenção e crescimento rápido.
Millipore
filtros HEPA
RADIAÇÃO GAMA (método físico)
• A radiação gama proveniente do Co-60 é uma onda
eletromagnética curta, de alta frequência e alta
energia que, assim como as microondas e as ondas
de rádio, faz parte do espectro natural de ondas
eletromagnéticas, um dos mais amplos da natureza.
Devido à sua energia, possui alto poder de
penetração.
• A energia transferida pela radiação gama provoca a
quebra da molécula de DNA dos microorganismos
através da retirada de elétrons orbitais dessas
moléculas.
• A quantidade de energia envolvida no processo é
desprezível e não provoca elevação de temperatura,
podendo ser classificado como um processo frio.
RADIAÇÃO
– Ionizante
• raios γ
• raios X
– Não-ionizante
• UV (260nm)
• micro-ondas
Fármacos, soros, vacinas
e material médico
Ar em ambientes
fechados
Cinética de morte: radicais livres muito reativos
lesão do DNA
GÁS (método químico)
-Equipamento especializado, exposição ao óxido de
etileno ou óxido de propileno (gases altamente
inflamáveis, quando misturados com ar – diluir com gás
inerte (dióxido carbono);
Tempo de 4 a 18 hrs de exposição – óxido etileno, age
interferindo as células bacterianas - liga-se a grupos
funcionais (-SH;-COOH; -OH).
- Gás de alto poder penetrante (útil em utensílios
cirúrgicos: cateteres, agulhas e seringas descartáveis;
certos antibióticos, preparações enzimáticas termolábeis,
material têxtil).
ALDEÍDOS – líquido (método químico)
Carcinogénico!
Esterilização de filtros HEPA.
- Utilizado para embalsamar.
• Formaldeído
• Glutaraldeído
Atuam por alquilação
mais eficaz e menos tóxico.
ativo na presença de matéria orgânica.
- Material hospitalar termo-sensível: -médico, -cirúrgico
Radiação gama
Desinfecção : Reduzida, Elevada, Intermediária.
Anti-sepsia
Lavagem de feridas e
pele pré-operatório.
Lavagem de mãos e
antebraços do cirurgião.
Lavagem de mãos
Desodorizantes
MÉTODO IDEAL:
 Rápido
 Eficaz contra todos microrganismos
 Não tóxico
 De fácil penetração
 Estável
 Aplicável a vários materiais e tecido humano
 Sem odor e cor
 Custo reduzido
PIROGÊNIO
PIROGÊNIO
- Década de 1912, a eliminação de bactérias por
esterilização térmica ou filtração, não eliminava a
pirogenicidade (febre) destas preparações. Esterilidade
não é sinônimo de apirogenicidade.
Pirogênios são substâncias orgânicas originadas de
microorganismos. Eles não estão vivos, mas há
presença de restos celulares e toxinas (endotoxinas
ou polissacarídeos da parede externa da célula
bacteriana). São responsáveis por muitas das reações
febris em pacientes após injeção intravenosa.
AÇÃO BIOLÓGICA:
- Muitas atividades biológicas estão atribuídas à unidade
lipídeo A da endotoxina, entre as quais: pirogenicidade,
toxicidade letal, leucopenia seguida de leucocitose,
necrose da medula óssea, reabsorção do osso
embrionário, agregação plaquetária...
Indução de febre:
- Envolve a fagocitose do lipídeo A
pirogênio endógeno
Atravessa barreira hematoencefálica
Altera o ponto de equilíbrio dos neurônios reguladores de temperatura
do hipotálamo
TESTE PARA PIROGÊNIO
TESTE IN VITRO:
- KIT “LAL”(teste lisado de amebócitos de Limulus) para
detecção de endotoxinas bacterianas.
- Extrato obtido de células sanguíneas de um crustáceo
(Limulus polyphemus) contém um sistema de proteínas e
enzimas que coagula na presença de baixos índices de
lipossacarídeos.
Sensibilidade do ensaio 0,25 –
0,015UE/mL
- Faz-se diluição do produto em mais de duas vezes o seu
volume (inibe a interferência dos ativos da formulação no
resultado do teste).
- Resultado positivo: Gelificação do lisado do amebócito
de Limulus
TESTE IN VIVO:
-Teste de pirogênio em coelhos: é um ensaio limite, com
a chance de aprovar ou rejeitar uma amostra, mediante
informações obtidas de um grupo de coelhos, e que
devem atender a um nível de padrão de estado febril.
- Cada grupo de animais recebe a injeção intravenosa da
amostra e é observado durante um período de ± 3hrs.
- Elevação térmica de pelo menos 0,5ºC é considerada
decorrente da inoculação de dose pirogênica de material
estranho.
Considerações:
- Quanto > nº de animais, mais segura decisão.
- Praticidade e Custos do ensaio.
- Reação fisiológica do animal.
PROCESSOS DE DESPIROGENIZAÇÃO
Inativação ou remoção das endotoxinas.
- INATIVAÇÃO: detoxificação da molécula (LPS), usando
tratamentos químicos ou altas temperaturas.
1.Hidrólise ácido-base (reduz/elimina atividade biológica
LPS – desativação lípídeo A).
2.Oxidação: Peróxido de Hidrogênio (oxidação dos
ácidos graxos presentes no lipídeo A) – outros:
hipoclorito, permanganato de potássio, ácido nítrico.
3.Alquilação (redução da atividade – óxido de etileno):
materiais termolábeis.
4.Processo térmico: calor seco (estufas – 250ºC – 30 min)
5.Radiação Ionizante - 60Co.
- REMOÇÃO DE ENDOTOXINAS
1. Destilação – água recém destilada, coletada emantida
em frascos despirogenizados estéreis é apirogênica.
2. Ultrafiltração: retidas no filtro.
3. Osmose reversa: filtração sob pressão.
4. Carvão ativo: baseado na adsorção de endotoxinas ao
carvão.
Obtenção de produtos apirogênicos
A partir dos métodos despirogenizantes, observa-se
limitações quanto à aplicação no produto terminado,
devido
Incompatibilidade de distintas naturezas, riscos envolvidos,
aspectos econômicos.
Exceto para água apirogênica!!
IMPORTÂNCIA em trabalhar todo processo produtivo em condições adequadas de:
-Higiene (operadores e ambiente);
-Matérias-primas com baixa carga microbiana;
-Processos validados;
-Pessoal Qualificado e Treinado;
-Aplicação de todos os conceitos de BPF.
Garantir que o produto seja obtido apirogênico no primeiro
processamento, dispensando reprocessos ou tratamentos adicionais!!!