avaliação da citotoxicidade da zidovudina sobre macrófagos

AVALIAÇÃO DA CITOTOCICIDADE DA ZIDOVUINA SOBRE
MACRÓFAGOS
Ana Cristina Colusso (IC voluntária-UNICENTRO), Deisy Alini Ruthes
(PAIC-UNICENTRO), Rubiana Mara Mainardes (Pesquisadora), Najeh
Maissar Khalil (Orientador), e-mail: [email protected].
Universidade Estadual do Centro-Oeste/Setor de Ciências da saúde.
Palavras-chave: Citotoxicidade, macrófagos, zidovudina, zymosan.
Resumo:
A zidovudina (AZT) é um fármaco utilizado como anti-retroviral, inibidor da
transcriptase reversa, e foi uma das primeiras drogas aprovadas para o
tratamento da AIDS. Porém, esse medicamento possui ação tóxica sobre a
medula óssea, levando a leucopenia, como também sobre outras células do
organismo. Este projeto tem por objetivo avaliar o possível efeito citotóxico
do AZT sobre macrófagos na ausência ou presença do ativador de
fagocitose, o zymosan. Os macrófagos utilizados neste experimento foram
obtidos a partir do exsudato peritoneal de ratos. Os macrófagos foram
incubados com soluções de AZT em tampão PBS-D, pelo período de 30
minutos, com zymosasn 0.5 mg/ml, e a possível citotoxicidade dos sistemas
sobre essas células foi avaliada pela técnica de exclusão do corante Azul de
Trypan. Conforme os resultados foi observado que o AZT exerce pouca
citotoxicidade sobre os macrófagos, nas condições testadas. O zymosan
aumento em ~260% a citotoxicidade sobre os macrófagos, e a incorporação
do AZT nesse sistema não alterou esse efeito.
Introdução
A presença do retrovírus HIV nas células humanas caracteriza uma doença
imunossupressora grave, síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS)
(Peçanha & Antunes, 2001), cujos agravantes são infecções oportunistas,
neoplasias e manifestações neurológicas associadas ao declínio no sistema
imunológico pela ação direta do vírus (Giammona et al., 1999).
No ciclo reprodutivo do vírus estão os principais alvos do tratamento
(Peçanha & Antunes, 2001), destacando-se a enzima transcriptase reversa,
sítio de ação dos chamados inibidores da transcriptase reversa, que têm
como principal representante a zidovudina (AZT) (Aymard, 2000).
O AZT foi o primeiro quimioterápico aprovado para uso clínico que
comprovadamente proporcionou benefícios clínicos importantes seja em
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combinação ou isoladamente. Entretanto, sua eficácia terapêutica é limitada
por seus efeitos hematológicos tóxicos (Oh et al., 1998; Thomas &
Panchagnula, 2003).
Os macrófagos são células pertencem ao sistema fagocitário humano,
distribuídos por todos os tecidos do organismo, sendo responsáveis pela
eliminação de restos celulares, bactérias, moléculas estranhas, etc.
(Verrasto, 2005). Quando ativados, produzem substâncias muitas vezes
autodestrutivas ( espécies oxidantes) com objetivo de eliminar por completo
qualquer partícula que seja nociva ao organismo (Bonacorsil et al, 2004),
mas que também exercem efeito citotóxicos sobre essas mesmas células.
Avaliar a ação citotóxica do AZT sobre os macrófagos torna-se dessa
forma, uma questão clinica, já que essas células são essenciais aos
mecanismos de defesa do organismo, em especial em paciente
imunossuprimidos. O zymosan é um polissacarídeo originado da parede
celular do Saccharomyces cerevisiae com atividade imunoestimulatória
devido a presença da β-glucana, em sua estrutura (Derbocio et al., 2005).
Células imunológicas como macrófagos, monócitos, neutrófilos e outras
células dendríticas expressam o receptor dectina-I, capaz de reconhecer o
zymosan (Willment, 2003), o que justifica o uso desse derivado, para
ativação ou estimulação dessas células.
Materiais e Métodos
Obtenção dos macrófagos
Os macrófagos foram obtidos a partir de exsudato peritoneal de ratos Wistar.
Em cada animal (machos com peso entre 100-160g) foram injetados via
intraperitoneal 5.0 mL de solução de glicogênio de ostra a 0,5% em NaCl a
0,85%. Após 72 h o animal foi sacrificado e a cavidade abdominal lavada
injetando-se 20mL de tampão fosfato-Dubecco sem Ca++ (PBS-D), contendo
10 UI de heparina/mL. O lavado peritoneal foi colhido através de sucção com
seringa e agulha. Posteriormente, foi transferido para um tubo cônico
siliconizado e centrifugado a 200xg, por 3min. As células sedimentadas
foram lavadas por duas vezes com PBS-D sem cálcio, sendo após contadas
em câmara de Neubauer. Durante os experimentos essas células
permaneceram em banho de gelo.
As células obtidas do exsudato intraperitoneal (5.5 x 10 5 células / 0,1 mL)
foram incubadas por 30min a 37°C com a solução de AZT nas
concentrações: 0,50µM e 100 µM e na ausência ou presença de zymosan
(0.5 mg/0.1 mL). Para a avaliação da viabilidade celular foi utilizado o
método do corante Azul de Trypan, cujo princípio é a não incorporação do
corante pelas células viáveis. Adicionaram-se volumes iguais de corante e
de suspensão celular e incubados por 5min. Após esse tempo, contaram-se
200 células em câmara de Neubauer, sendo verificadas as células que
incorporaram ou não o corante.
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Resultados e Discussão
A tabela 1 apresenta o efeito do sistema AZT/zymosan sobre macrófagos. O
AZT apresenta baixa citotoxicidade sobre macrófagos, nas concentrações e
temo testados. O zymosan aumentou em ~260% o efeito citotóxico sobre as
células, e a incorporação do AZT nesse sistema não provocou alterações
significantes sobre a citotoxicidade nos macrófagos. Alguns trabalhos
relatam que o AZT em meio com macrófagos estimulados promove aumento
da formação de espécies oxidantes, demonstrando o efeito pró-oxidante
desse fármaco em sistemas fagocíticos (Komarov et al, 2004). É bem
estabelecido que as espécies reativas de oxigênio formadas durante a
fagocitose podem levar a efeitos citotóxicos sobre as células. Os resultados
apresentados indicam que o AZT não exarceba os efeitos citotóxicos do
zymosan em macrófagos.
Tabela 1. Efeito citotóxico do sistema AZT (µM)/zymosan (0.5 mg/0.1 mL) sobre
macrófagos (5.5 x 105 células/mL) avaliado pela incorporação do corante azul de
trypan.
Ensaio (AZT µM)
% células mortas (média±desvio
padrão)
S/ AZT
7,5±2,12
AZT50
11,5±3,54
AZT100
8,5±2,12
ZYMOSAN
19,5±2,12
ZYM/AZT50
15,5±0,71
ZYM/AZT100
18,5±0,71
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Conclusões
Nas condições testadas e conforme os resultados, o AZT não determinou
aumento do efeito citotóxico do zymosan sobre macrófagos.
Referências
Peçanha, E.P., Antunes, O.A.C., Estratégias faramcológicas para
terapia anti-AIDS, Rev. Quim. Nova, 2001, 25 (6).
Gianomma, G.; Cavallaro, G.; Pitaressi, G. Studies of macromolecular
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