Título do Projeto de Pesquisa - pibic

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
DEPARTAMENTO DE PESQUISA
PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA –
PIBIC CNPq e PIBIC UFPA
RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO
Período: agosto / 2014 a agosto / 2015
(
) PARCIAL
( x ) FINAL
IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO
Título do Projeto de Pesquisa:
A resposta inflamatória microglial na ambliopia: estudo experimental em gatos.
Nome do Orientador:
Prof. Dra Luciana Negrão Frota de Almeida.
Titulação do Orientador:
Doutor
Faculdade:
Universidade Federal do Pará
Unidade:
Instituto de Ciências Biológicas
Laboratório:
Laboratório de Neurodegeneração e Infecção
Título do Plano de Trabalho:
Avaliação da resposta inflamatória microglial em gatos submetidos à ambliopia
experimental criados em ambiente enriquecido e padrão.
Nome do Bolsista:
Sanaira Suyan Lima Soares
Tipo de Bolsa :
(
) PIBIC/CNPq
( x ) PIBIC/UFPA
(
) PIBIC/INTERIOR
(
) PARD
(
) PIBIC/CNPq – cota do pesquisador
(
) PIBIC/FAPESPA
INTRODUÇÃO
Interações competitivas entre as aferências dos dois olhos esculpem e
consolidam circuitos corticais na vida adulta. A experiência visual se inicia
quando os olhos abrem, mas as modificações plásticas do desenvolvimento têm
que esperar pelo período crítico que começa seis a quatorze dias depois em
modelos felinos. Entre a abertura dos olhos e o período crítico, muitas
transformações acontecem, mas parecem independentes da experiência visual.
Entretanto, a manutenção de tais transformações na vida adulta requer a
estimulação com padrões espaciais durante o período crítico (Smith et al., 2007).
Se um dos olhos é privado desses estímulos, instala-se a ambliopia, uma doença
que se caracteriza pela diminuição da acuidade visual em olhos aparentemente
saudáveis, afetando uma série de tarefas visuomotoras que dependem da
integridade da visão binocular (VB).
Sabe-se que o enriquecimento ambiental, devido à estimulação visual e
física, induz uma melhoria na quantidade, distribuição e morfologia de células
neuronais e gliais, assim como altera a matriz extracelular aumentando a
plasticidade cerebral. Essa plasticidade está intimamente relacionada à
recuperação de diversas patologias neurodegenerativas.
Até o presente a maioria dos ensaios dedicados à compreensão das
bases neuropatológicas da ambliopia se restringiu a investigar as alterações
oculares, talâmicas e do córtex visual primário, não havendo esforço sistemático
equivalente dedicado as áreas de maior hierarquia igualmente relevantes para o
desempenho visuomotor e cognitivo que dependem de interação binocular. No
presente projeto pretende-se investigar em modelo felino adulto as possíveis
alterações neuropatológicas, com ênfase na resposta inflamatória tecidual
subsequente a retração dos terminais axonais do olho amblíope, assim como a
sua possível recuperação pela estimulação do ambiente enriquecido após a
remoção
da
privação.
Pretende-se
analisar
possíveis
correlatos
neuroinflamatórios em áreas corticais visuais associativas de alta hierarquia,
correlacionando-as às performances visuomotoras dependentes de interação
binocular assim como o seu possível impacto sobre funções cognitivas que
requerem tais interações.
JUSTIFICATIVA
De importância epidemiológica, a ambliopia responde por cerca de 1%
das perdas permanentes de visão encontradas na zona rural em países em
desenvolvimento e por cerca de 50% dos casos de visão reduzida unilateral
permanente e.g. (Saw et al., 2003; He et al., 2007; Maida et al., 2008).
As causas mais frequentes de ambliopia são os erros de refração e o
estrabismo. Sabe-se que a privação de um dos olhos induz expansão da coluna
de dominância ocular do olho não privado na região de representação do campo
binocular no córtex visual durante o desenvolvimento, mas não em adultos. Essa
estabilidade estrutural e funcional na circuitaria cortical de adultos, por outro lado,
restringe a recuperação de funções perdidas no início da vida. Na ambliopia, por
exemplo, detectou-se que a probabilidade de recuperação da visão do olho
privado é maior quando a retirada da privação monocular é feita no início do
desenvolvimento, em comparação a estágios tardios da vida pós-natal (He et al.,
2007).
O ambiente enriquecido é uma condição caracterizada pela presença de
estímulos multisensoriais adequados para realização de tarefas visuomotoras
espontâneas que induzem o aumento do comportamento exploratório e da
estimulação sensório-motora como estratégia para aumentar a plasticidade
cerebral em adultos. Estudos recentes demonstraram que o enriquecimento
ambiental promove uma total recuperação da acuidade visual e da dominância
ocular em animais adultos com ambliopia (Sale et al., 2007) justificando o esforço
dedicado à compreensão das bases celulares e moleculares que permitem tal
recuperação.
OBJETIVO GERAL
Analisar a resposta inflamatória no córtex visual primário e em áreas
associativas que exibem função binocular, após indução da ambliopia
experimental e verificar o papel do ambiente enriquecido sobre a acuidade visual
binocular em modelo felino jovem.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Descrever a organização da matriz extracelular através da caracterização
morfológica das redes perineurais das áreas corticais visuais do animal no
ambiente padrão e ambiente enriquecido.

Caracterizar a morfologia microglial e das redes perineuronais com auxílio
de procedimentos morfométricos no córtex visual, comparando os animais do
ambiente enriquecido e padrão com ou sem ambliopia experimental.
Materiais e Métodos:
Foram criados oito gatos (Felis catus), em duas ninhadas de quatro
animais por fêmea, em ambiente padrão num espaço com aproximadamente
24m2, respeitando o ciclo claro-escuro, com água e ração ad libitum.
No
vigésimo terceiro dia (D23), cinco desses animais foram submetidos à indução
de ambliopia através da utilização de colírio (sulfato de atropina 1%, 1 gota) em
um dos olhos (esquerdo), uma vez ao dia. Quatro dos animais foram utilizado
como controle recebendo 1 gota de colírio placebo (com o veículo) no lugar do
colírio de atropina.
(Figura 1) Olho esquerdo do animal sobe efeito do colírio de atropina a 1%.
Antes da indução da ambliopia nesses animais, percebeu-se a
necessidade de realizar a refração de todos os gatos para excluir possíveis
fatores ambliogênicos que já existissem nos animais tais como: anisometropia,
altas isometropias e opacidades dos meios visuais. Os resultados de todos os
felinos demonstraram que o equivalente esférico variou de -1,50 a +1,50
dioptrias e nenhum dos gatos apresentava tais fatores.
Diante disso, 4 gatos controles e 4 atropinizado foram perfundidos
transcardiacamente com fixadores aldeídicos para em seguida ser realizado
corte e histoquímica para Wisteria floribunda e contracoloração pelo violeta de
cresila. Esses foram criados por três meses até terem sido realizadas suas
respectivas perfusões.
Perfusão e procedimentos histológicos
Todos os gatos perfundidos foram pesados e sacrificados com overdose
de cetamina (95mg/Kg) e xilazina (4mg/Kg) (Konig Laboratories). A perfusão foi
realizada por via transcardíaca com salina heparinizada por 10 minutos, seguido
por 2L de paraformaldeido a 4% em tampão fosfato, pH 7.2-7.4) e crioproteção
de 10, 20 e 30% nos volumes de 1L, 500ml e 500ml, respectivamente. Seguiuse a craniotomia para retirada do encéfalo e seccionamento em criostato a
120µm de espessura, sendo os cortes coletados serialmente. Uma em cada
nove secções foram utilizadas para histoquímica de receptores da lecitina
Wisteria floribunda.
( A)
(Figura 2) Perfusão e craniotomia. (A) encéfalo do felino retirado após perfusão.
O protocolo utilizado é o que se segue: as secções selecionadas foram
lavadas 3 vezes em tampão Tris-Triton 5% por 5 minutos. Logo após foram
transferidas para solução de metanol com peróxido de hidrogênio 0,3% por mais
20 minutos e então lavadas 2 vezes em tampão Tris-Triton 5% por 5 minutos e
incubadas por 20 minutos na mesma solução. Após lavagem em tampão TrisTriton 5%, as secções foram incubadas por 12 horas em solução de lectina
diluída em Tris (10µg/ml). Em seguida, ficaram imersas em solução de complexo
avidina-biotina-peroxidase (ABC, Vector Laboratories, USA, 1:200) por uma
hora, com 3 subsequentes lavagens em tampão Tris 0,1M por 2 minutos cada.
Após as lavagens as secções foram incubadas em tampão acetato 0,2M pH 6,0
por 5 minutos e processadas para a histoquímica de peroxidase com o método
que utiliza a glicose oxidase e DAB-nickel
A reação era interrompida depois que o objeto de interesse era detectado
em microscópio em sua inteireza. As secções foram então lavadas 3 vezes,
durante 2 minutos cada, em PB 0.1M pH 7.2-7.4, montadas em lâminas
gelatinizadas, desidratadas em álcool e xileno e seladas com lamínula e meio de
inclusão (entelan Merck). Em algumas lâminas foi realizado contra-coloração de
nissl com violeta de cresila seguindo a sequência da tabela a seguir:
SOLUÇÕES
TEMPO (MINUTOS)
ÁLCOOL 70%
1
ÁLCOOL 80%
1
ÁLCOOL 90%
1
ÁLCOOL 100% I
3
ÁLCOOL 100% II
5
ÁLCOOL 100% + CLOROFÓRMIO (1:1)
10
ÁLCOOL 95%
3
ÁLCOOL 75%
3
ÁGUA DESTILADA PARA LAVAGEM
0,15
CRESIL VIOLETA (40ºC)
1-4
ÁGUA DESTILADA PARA LAVAGEM
0,15
ÁLCOOL 80%
3
ÁLCOOL 90%
10
ÁLCOOL 100% + CLOROFÓRMIO (1:1)
3
ÁLCOOL 95% + ÁCIDO ACÉTICO (15 gts/100ml)
3
ÁLCOOL 95%
6
ÁLCOOL 100% + álcool butílico (1:1)
3
XILENO I
5
XILENO II
5
RESULTADOS
Os resultados apresentados a seguir confirmam a eficácia do método
utilizado para ambliopização dos felinos. Para isso, foram analisadas colunas
de dominância na região binocular do córtex visual de um animal amblíope
(atropinizado) e um animal não amblíope (controle).
Inicialmente foi delimitada os limites lateral e medial da região de interesse
a ser estudada. Nota-se que nesses locais de transição a marcação das redes
perineuronias diminui de intensidade e as camadas supragranulares na
vizinhança com a área 18 expandem, determinando assim o limite lateral da área
de interesse (área 17 de Brodmann). Da mesma forma a densidade de marcação
das redes diminui quando o limite medial é alcançado (Figure 3).
(Figura 3) Painel de imagens dos limites medial e lateral da área 17 de Brodmann. (E) limite
medial e (F) limite lateral.
No que diz respeito às colunas de dominância ocular na região binocular
(figura 4), ao se comparar as imagens do animal atropinizado e do controle,
percebe-se um padrão diferente entre os dois, onde no animal atropinizado é
nítida a alternâcia no que concerne a intensidade de marcações das redes
perineuronais observadas principalmente a partir das camadas IV α e IVβ. Já no
animal controle, as imagens das colunas de dominância na região binocular,
apresentam uma continuidade ao longo de toda a camada IV α e VI.
(Figura 4) Painel de imagens da área 17 de Brodmann destacando as colunas de dominância.
Animal controle (A), colunas de dominânica indistinguíveis. Imagens da área 17 do animal
atropinizado (B), existência de descontinuidade na matriz extracelular contendo as redes
perineuronais na região de representação do olho atropinizado.
(Figura 5) Foto do animal atropinizado (3,4), com destaque em vermelho (4) para os locais onde
há descontinuidade intensa das redes perineurais.
Para identificação mais precisa da localização dessa alternância de
colunas em se tratando das camadas do córtex visual do gato atropinizado, foi
feito a contracoloração de Nissl com violeta de cresila, para melhor visualização
das camadas histológicas que compõem o córtex visual primário. (Figura 6)
(figura 6) foto da área 17 de brodmann, hemisfério direito, gato atropinizado. Os númeors
romanos (I, II, IIIa, IIIb, IIIc e IVα, IVβ, V e VI) representam as camadas histólogicas do córtex
visual.
PUBLICAÇÕES
Ainda não há publicações.
CONCLUSÃO
O estudo ainda está em andamento, aguardamos a finalização do projeto
para alcançarmos as respostas aos nossos objetivos.
BIBLIOGRAFIA:
Bonthiusa DJ, McKimd R, Koelea L, Harba H, Karacaya B, Mahoneya J,
Pantazis NJ. Use of frozen sections to determine neuronal number in the
murine hippocampus and neocortex using the optical disector and optical
fractionator. Brain Research Protocols 14 (2004) 45–57.
Bussey TJ, Muir JL, Aggleton JP. Functionally Dissociating Aspects of Event
Memory: the Effects of Combined Perirhinal and Postrhinal Cortex Lesions on
Object and Place Memory in the Rat. The Journal of Neuroscience, 1999,
19(1):495–502.
Cheng G, Mustari M, Khanna S, Porter J (2003) Comprehensive evaluation of
the extraocular muscle critical period by expression profiling in the dark-reared
rat and monocularly deprived monkey. IOVS 44(9).
Chung STL, Li RW, Levi DM (2006) Identification of contrast-defined letters
benefits from perceptual learning in adults with amblyopia. Vision Research
46:3853-3861.
Dere E, Huston JP, Silva MAS (2005) Episodic-like memory in mice:
Simultaneous assessment of object, place and temporal order memory. Brain
Research Protocols 16:10-19.
Erisir A, Harris JL (2003) Decline of the critical period of visual plasticity is
concurrent with the reduction of NR2B subunit of the synaptic NMDA receptor
in layer 4. The Journal of Neuroscience 23(12):5208-5218.
Fagiolini M, Hensch TK (2000) Inhibitory threshold for critical-period activation
in primary visual cortex. Nature 404.
Fischer QS, Graves A, Evans S, Lickey ME, Pham TA (2007) Monocular
deprivation in adult mice alters visual acuity and single-unit activity. Lern. Mem.
14:277-286.
Galtrey CM, Fawcett JW (2007) The role of chondroitin sulfate proteoglycans
in regeneration and plasticity in the central nervous system. Brain Research
Reviews 54:1-18.
Gingras G, Mitchell DE, Hess RF (2005) Haphazard neural connections
underlie the visual deficits of cats with strabismic or deprivation amblyopia.
European Journal of Neuroscience 22:119-124.
Giovannelli A, Marco SD, Maccarone R, Bisti S (2008) Long-term dark rearing
induces permanent reorganization in retinal circuitry. Biochemical and
Biophysical Research Communications 365:349-354.
He H, Ray B, Dennis K, Quinlan EM (2007) Experience-dependent recovery of
vision
following
chronic deprivation
ambliopya.
Nature
Neuroscience
10(9):1134-1136.
He M, Huang W, Zheng Y, Huang L, Ellwein LB (2007) Refractive Error and
Visual Impairment in School Children in Rural Southern China. Ophthalmology
114(2):374-382.
Hensch TK, Fagiolini M, Mataga N, Stryker MP, Baekkeskov S, Kash SF (1998)
Locam GABA circuit control of experience-dependent plasticity in developing
visual cortex. Science 282:1504-1508.
Huang J, Kirkwood A, Pizzorusso T, Porciatti V, Morales B, Bear MF, Maffei L,
Tonegawa, S (1999) BDNF Regulates the Maturation of Inhibition and the
Critical Period of Plasticity in Mouse Visual Cortex. Cell 98:739-755.
Iny K, Heynen AJ, Sklar E, Bear MF (2006) Bidirectional modifications of visual
acuity induced by monocular deprivation in juvenile and adult rats. J. Neurosci.
26(28):7368-7374.
Iseri PK, Altinas O, Tokay T, Yuksel N (2006) Relationship between cognitive
impairment and retinal morphological and visual functional abnormalities in
Alzheimer disease. J Neuro-Ophthalmol 26:18-24.
Ko TH, Fujimoto JG, Schuman JS, Paunescu LA, Kowalevicz AM, Hartl I,
Drexler W, Wollstein G, Ishikawa H, Duker J (2005) Comparison of ultrahighand standard-resolution optical coherence tomography for imaging macular
pathology. Ophthalmology 112(11):1922.e1-1922.15.
Lehmann K, Lowel S (2008) Age-dependent ocular dominance plasticity in
adult mice. PLoS ONE 3(9):e3120.
Lempert P (2008) Retinal area and optic disc rim area in amblyopic, fellow, and
normal hyperopic eyes: a hypothesis for decreased acuity in amblyopia.
Ophthalmology.
Levi DM (2008) Crowding-An essential bottleneck for object recognition: a minireview. Vision Research 48:635-654.
Maida JM, Mathers K, Alley CL (2008) Pediatric ophthalmology in the
developing world. Curr Opin Ophthalmol 19(5):403-8.
Magnaghi V (2007) GABA and Neuroactive Steroid Interactions in Glia: New
Roles for Old Players? Current Neuropharmacology 5:47-64.
Morishita H, Hensch TK (2008) Critical period revisited: impact on vision.
Current Opinion in Neurobiology 18:101-107.
Paquet C, Boissonnot M, Roger F, Dighiero P, Gil R, Hugon J (2007) Abnormal
retinal thickness in patients with mild cognitive impairment and Alzheimer’s
disease. Neuroscience Letters 420:97-99.
Parisi V, Restuccia R, Fattapposta F, Mina C, Bucci MG, Pierelli F (2001)
Morphological and functional retinal impairment in Alzheimer’s disease
patients. Clinical Neurophysiology 112:1860-1867.
Pham TA, Impey S, Storm DR, Stryker MP (1999) CRE-Mediated gene
transcription in neocortical neuronal plasticity during the developmental critical
period. Neuron 22(1):63-72.
Pizzorusso T, Medini P, Berardi N, Chierzi S, Fawcett JW, Maffei L (2002)
Reactivation of ocular dominance plasticity in the adult visual córtex. Science
298:1248-1251.
Porciatti V, Pizzorusso T, Maffey L (1999) Vision in mice with neuronal
redundancy due to inhibition of developmental cell death. Visual Neuroscience
16:721-726.
Prusky GT, West PWR, Douglas RM (2000) Behavioral assessment of visual
acuity in mice and rats. Vision Research 40:2201-2209.
Robaei D, Huynh SC, Kifley A, Mitchell P (2006) Correctable and noncorrectable visual impairment in a population-based sample of 12-year-old
Australian children. American Journal of Ophthalmology 142(1):112-118.
Roux N, Amar M, Moreau A, Baux G, Fossier P (2008) Impaired GABAergic
transmission disrupts normal homeostatic plasticity in rat cortical networks.
European Journal of Neuroscience 27:3244-3256.
Sale S, Vetencourt M, Medini P, Cenni MC, Bsroncelli L, Pasquale R, Maffei L
(2007) Environmental enrichment in adulthood promotes ambliopya recovery
through a reduction of intracortical inhibition. Nature Neuroscience 10(6):679681.
Saw S-M, Husain R, Gazzard GM, Koh D, Widjaja D, Tan DTH (2003) Causes
of low vision and blindness in rural Indonesia. Br. J. Ophthalmol. 83:1075-1078.
Shu SY, Ju G, Fan LZ. The glucose oxidase-DAB-nickel method in peroxidase
histochemistry of the nervous system. Neurosci Lett. 1988, (2):169-71.
Smith
SL,
Trachtenberg
JT
(2007)
Experience-dependent
binocular
competition in the visual cortex begins at eye opening. Nature Neuroscience
10(3):370-375.
Wilson IA, Gallagher M, Eichnbaum H, Tanila H (2006) Neurocognitive aging:
prior memories hinder new hippocampal encoding. Trends in Neurosciences
29(12):662-670.
Wong A, Brown RE (2007) Age-related changes in visual acuity, learning and
memory in C57BL/6J and DBA/2J mice. Neurobiology of Aging 28:1577-1593.
Zhou Y, Huang C, Xu P, Tao L, Qiu Z, Li X, Lu Z-L (2006) Perceptual learning
improves contrast sensitivity and visual acuity in adults with anisometropic
amblyopia. Vision Research 46:739-750.
DIFICULDADES
Obtenção dos felinos para a pesquisa, o que levou a dificuldade na obtenção
de resultados mais rápido.
PARECER DO ORIENTADOR: Manifestação do orientador sobre o
desenvolvimento das atividades do aluno e justificativa do pedido de
renovação, se for o caso.
DATA : ______/_________/________
ASSINATURA DO ORIENTADOR
ASSINATURA DO ALUNO
FICHA DE AVALIAÇÃO DE RELATÓRIO DE BOLSA DE INICIAÇÃO
CIENTÍFICA
O AVALIADOR DEVE COMENTAR, DE FORMA RESUMIDA, OS SEGUINTES
ASPECTOS DO RELATÓRIO:
1. O projeto vem se desenvolvendo segundo a proposta aprovada? Se
ocorreram mudanças significativas, elas foram justificadas?
2. A metodologia está de acordo com o Plano de Trabalho ?
3. Os resultados obtidos até o presente são relevantes e estão de acordo com
os objetivos propostos?
4. O plano de atividades originou publicações com a participação do bolsista?
Comentar sobre a qualidade e a quantidade da publicação. Caso não tenha
sido gerada nenhuma, os resultados obtidos são recomendados para
publicação? Em que tipo de veículo?
5. Comente outros aspectos que considera relevantes no relatório
6. Parecer Final: Aprovado ( )
7. Aprovado com restrições (
recomendações)
8. Reprovado ( )
) especificar se são mandatórias ou
9. Qualidade do relatório apresentado: (nota 0 a 5) _____________
Atribuir conceito ao relatório do bolsista considerando a proposta de plano, o
desenvolvimento das atividades, os resultados obtidos e a apresentação do
relatório.
Data : _____/____/_____.
________________________________________________
Assinatura do(a) Avaliador(a)