LOWRY et al., 1951

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PROTOCOLO PARA
DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS
LOWRY et al., 1951
adaptado por Andreone Teles Medrado, 2011
1. EXTRAÇÃO DAS PROTEÍNAS
1.1 PRECIPITAÇÃO E SOLUBILIZAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS
Todo este procedimento deve ser realizado utilizando-se tubos eppendorf de 2 mL
Pesar o tecido congelado (a quantidade utilizada dependerá da espécie e tecido) e
adicionar 5 volumes de PCA 6% (=0,6M)
Exemplo: 100mg (de tecido) + 500μl (de PCA)
Homogeneizar (No microprocessador)- até que a solução fique homogênea
Centrifugar por 5 minutos a 11.100 rpm em centrífuga Eppendorf e descartar o
sobrenadante
Ressuspender o pellet em 4 volumes de PCA 6% e centrifugar por 5
minutos/11.100rpm.
Exemplo: 100mg (de tecido) + 400 μl (de PCA)
Repetir o processo por 3x.
- NÃO esquecer de usar o vórtex / após utilizar o PCA
Tratar o precipitado com 14 volumes de KOH 2,5%. Agitar e deixar
aproximadamente por 20-24 horas, sob agitação constante, até solubilização completa.
(150rpm Shaker).
Exemplo: 100mg (de tecido) + 1400 μl (de KOH)
Continuar dia seguinte (depois da retirada das amostras do shaker as mesmas devem
ser guardadas em geladeira -20°C (caso não sejam utilizadas no mesmo momento por
até 7 dias)
1.2 SOLUÇÕES
A) PCA (Ácido Perclórico) 6%: 6M: HClO4 – 70% d= 1,67 P= 100,47
51,6ml de PCA para 1000ml de H2O
5,16 ml de PCA para 100ml de H2O
2,58 ml de PCA para 50ml de H2O
B) KOH: 2,5% _________ 2,5g KOH em 100 ml de H2O
2. DETERMINAÇÃO DAS PROTEÍNAS TOTAIS
1° PASSO- DILUIÇÃO
 Para cada tecido e espécie utilizada uma diluição diferente do homogenado obtido
previamente deverá ser realizada, segue um exemplo da diluição de tecido muscular e
gonadal de Salminus hilarii
 100x (MB)= 990 μl (água) + 10μl (homogenado) = (990+10)/10
 80x (GON)= 790μl + 10 μl = (790+10)/10
- Estas diluições servirão como amostras mãe utilizadas na determinação.
Realizar as diluições em eppendorf cônico de 1,5 mL, depois passar 200μl dessa
diluição para os tubos de ensaio referente a cada amostra.
2° PASSO- PREPARAÇÃO DA CURVA PADRÃO (ALBUMINA)
-NaOH= 4g para 100mL de água (1N)
- Solução Padrão de BSA = 0,02mg de Albumina bovina (Sigma)+ 0,1 mL de NaOH (1N)
para 100mL de água (aliquotar (pipetar) em tubos de 2mL e guardar em freezer -20°C).
 Os padrões são feitos em duplicada, 5 padrões em concentrações crescentes de
albumina para adequação das amostras em curva padrão.
Amostra
Concentração (g/mL)
BSA- μl
Água - μl
Branco
0
0
200
P1
0,04
40
160
P2
0,08
80
120
P3
0,12
120
80
P4
0,16
160
40
P5
0,20
200
0
Exemplo de uma Curva Padrão Albumina:
0,25
CONCENTRAÇÃO
0,2
y = 1,115x + 0,0096
R² = 0,9997
0,15
0,1
0,05
0
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
ABSORBÂNCIA
Curva Padrão Albumina 0,2mg/ml (200μl/ml), feita por Andreone Teles Medrado, Julho de 2011.
3° PASSO- ADIÇÃO DE REAGENTES PARA DETERMINAÇÃO DAS PROTEÍNAS
TOTAIS
1- MISTURA REATIVA (MR): Adicionar 1mL mistura reativa por amostra- inclusive nos
padrões e branco
 (MR): para fazer esta mistura é necessário se atentar para as quantidades de cada
solução.
 SEMPRE USAR: 10mL de Solução alcalina / 100L de sulfato de cobre / 100L de
tartarato (sempre seguindo essa proporção), porém, na seguinte sequência:
1º- Sulfato de Cobre(CuSO4) 2%
2º-Tartarato (Sódio e Potássio) 4%
3º-Solução Alcalina (Na2CO3-5g+ NaOH-1g para 250ml)
Agitar muito bem a Solução Alcalina por no mínimo 30 segundos antes de preparar a
Mistura Reativa.
2- FOLIN CIOCALTEAU: Adicionar 100 L de solução de folin+água em cada amostrainclusive nos padrões e branco.
Folin: 1μl Folin + 1 μl H2O (1:1)
100μl por amostra
É necessário esperar 30m min para realizar a leitura. Seguir as instruções do
aparelho:
Pipetar apenas 290μl de cada
amostra, padrão e branco por
poço da placa de Elisa
3- LEITURA NO ESPECTROFOTÔMETRO
1. Ligar o Espectrofotômetro
6. Abrir a bandeja – Drawer
2. Ligar o Computador
7. Colocar a Placa no aparelho
3. Abrir o Programa SoftMax (na área de
8. Fechar a bandeja - Drawer
trabalho)
9. Agitar a bandeja levemente
4. Setings (660nm)
10. Iniciar a leitura (Reader)
5. Templates (“numerar” a Placa Elise):
11. Salvar Planilha (Save).
-Protocolos;
-Protein quant;
-LOWRY;
-Indicar concentração dos poços
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