PROTOCOLO PARA DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS LOWRY et al., 1951 adaptado por Andreone Teles Medrado, 2011 1. EXTRAÇÃO DAS PROTEÍNAS 1.1 PRECIPITAÇÃO E SOLUBILIZAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS Todo este procedimento deve ser realizado utilizando-se tubos eppendorf de 2 mL Pesar o tecido congelado (a quantidade utilizada dependerá da espécie e tecido) e adicionar 5 volumes de PCA 6% (=0,6M) Exemplo: 100mg (de tecido) + 500μl (de PCA) Homogeneizar (No microprocessador)- até que a solução fique homogênea Centrifugar por 5 minutos a 11.100 rpm em centrífuga Eppendorf e descartar o sobrenadante Ressuspender o pellet em 4 volumes de PCA 6% e centrifugar por 5 minutos/11.100rpm. Exemplo: 100mg (de tecido) + 400 μl (de PCA) Repetir o processo por 3x. - NÃO esquecer de usar o vórtex / após utilizar o PCA Tratar o precipitado com 14 volumes de KOH 2,5%. Agitar e deixar aproximadamente por 20-24 horas, sob agitação constante, até solubilização completa. (150rpm Shaker). Exemplo: 100mg (de tecido) + 1400 μl (de KOH) Continuar dia seguinte (depois da retirada das amostras do shaker as mesmas devem ser guardadas em geladeira -20°C (caso não sejam utilizadas no mesmo momento por até 7 dias) 1.2 SOLUÇÕES A) PCA (Ácido Perclórico) 6%: 6M: HClO4 – 70% d= 1,67 P= 100,47 51,6ml de PCA para 1000ml de H2O 5,16 ml de PCA para 100ml de H2O 2,58 ml de PCA para 50ml de H2O B) KOH: 2,5% _________ 2,5g KOH em 100 ml de H2O 2. DETERMINAÇÃO DAS PROTEÍNAS TOTAIS 1° PASSO- DILUIÇÃO Para cada tecido e espécie utilizada uma diluição diferente do homogenado obtido previamente deverá ser realizada, segue um exemplo da diluição de tecido muscular e gonadal de Salminus hilarii 100x (MB)= 990 μl (água) + 10μl (homogenado) = (990+10)/10 80x (GON)= 790μl + 10 μl = (790+10)/10 - Estas diluições servirão como amostras mãe utilizadas na determinação. Realizar as diluições em eppendorf cônico de 1,5 mL, depois passar 200μl dessa diluição para os tubos de ensaio referente a cada amostra. 2° PASSO- PREPARAÇÃO DA CURVA PADRÃO (ALBUMINA) -NaOH= 4g para 100mL de água (1N) - Solução Padrão de BSA = 0,02mg de Albumina bovina (Sigma)+ 0,1 mL de NaOH (1N) para 100mL de água (aliquotar (pipetar) em tubos de 2mL e guardar em freezer -20°C). Os padrões são feitos em duplicada, 5 padrões em concentrações crescentes de albumina para adequação das amostras em curva padrão. Amostra Concentração (g/mL) BSA- μl Água - μl Branco 0 0 200 P1 0,04 40 160 P2 0,08 80 120 P3 0,12 120 80 P4 0,16 160 40 P5 0,20 200 0 Exemplo de uma Curva Padrão Albumina: 0,25 CONCENTRAÇÃO 0,2 y = 1,115x + 0,0096 R² = 0,9997 0,15 0,1 0,05 0 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 ABSORBÂNCIA Curva Padrão Albumina 0,2mg/ml (200μl/ml), feita por Andreone Teles Medrado, Julho de 2011. 3° PASSO- ADIÇÃO DE REAGENTES PARA DETERMINAÇÃO DAS PROTEÍNAS TOTAIS 1- MISTURA REATIVA (MR): Adicionar 1mL mistura reativa por amostra- inclusive nos padrões e branco (MR): para fazer esta mistura é necessário se atentar para as quantidades de cada solução. SEMPRE USAR: 10mL de Solução alcalina / 100L de sulfato de cobre / 100L de tartarato (sempre seguindo essa proporção), porém, na seguinte sequência: 1º- Sulfato de Cobre(CuSO4) 2% 2º-Tartarato (Sódio e Potássio) 4% 3º-Solução Alcalina (Na2CO3-5g+ NaOH-1g para 250ml) Agitar muito bem a Solução Alcalina por no mínimo 30 segundos antes de preparar a Mistura Reativa. 2- FOLIN CIOCALTEAU: Adicionar 100 L de solução de folin+água em cada amostrainclusive nos padrões e branco. Folin: 1μl Folin + 1 μl H2O (1:1) 100μl por amostra É necessário esperar 30m min para realizar a leitura. Seguir as instruções do aparelho: Pipetar apenas 290μl de cada amostra, padrão e branco por poço da placa de Elisa 3- LEITURA NO ESPECTROFOTÔMETRO 1. Ligar o Espectrofotômetro 6. Abrir a bandeja – Drawer 2. Ligar o Computador 7. Colocar a Placa no aparelho 3. Abrir o Programa SoftMax (na área de 8. Fechar a bandeja - Drawer trabalho) 9. Agitar a bandeja levemente 4. Setings (660nm) 10. Iniciar a leitura (Reader) 5. Templates (“numerar” a Placa Elise): 11. Salvar Planilha (Save). -Protocolos; -Protein quant; -LOWRY; -Indicar concentração dos poços