Estruturação genética de golfinhos-rotadores (Stenella longirostris
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Estruturação genética de golfinhos-rotadores (Stenella longirostris Gray, 1828) no litoral brasileiro Drienne Messa Faria Dissertação de Mestrado em Biodiversidade Tropical Mestrado em Biodiversidade Tropical Centro Universitário Norte do Espírito Santo Universidade Federal do Espírito Santo São Mateus, fevereiro de 2013 Dados Internacionais de Catalogação-na-publicação (CIP) (Biblioteca Central da Universidade Federal do Espírito Santo, ES, Brasil) F224e Faria, Drienne Messa, 1986 Estruturação genética de golfinhos-rotadores (Stenella longirostris Gray, 1828) no litoral brasileiro / Drienne Messa Faria. – 2013. 68 f. : il. Orientadora: Ana Paula Cazerta Farro. Dissertação (Mestrado em Biodiversidade Tropical) – Universidade Federal do Espírito Santo, Centro Universitário Norte do Espírito Santo. 1. Cetáceos. 2. Microssatélites (Genética). 3. Golfinho. 4. Genética. I. Farro, Ana Paula Cazerta. II. Universidade Federal do Espírito Santo. Centro Universitário Norte do Espírito Santo. III. Título. CDU: 502 À minha família por ser o alicerce da minha vida e o meu porto seguro. AGRADECIMENTOS À Profa. Dra. Ana Paula Cazerta Farro, minha orientadora, pelo apoio, amizade e dedicação, por toda confiança em mim depositada e por contribuir para o meu amadurecimento intelectual e pessoal. A todos os professores do Programa de Pós-graduação em Biodiversidade Tropical (PPGBT) por dividirem seus conhecimentos e informações. Aos amigos do Laboratório de Genética Vegetal do Departamento de Genética do Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista (UNESP-Botucatu, SP) por me receberem com muito carinho e me ajudarem na identificação dos fragmentos de microssatélites. Em especial, ao Prof. Dr. Celso Luís Marino que possibilitou a utilização deste laboratório e a Júlio Otto, Vanusa Otto e Cíntia Helena Sagawa por terem me ajudado muito nos procedimentos laboratoriais. Aos amigos do Laboratório de Genética Animal (LGA) da Embrapa de Brasília, especialmente ao Prof. Dr. Samuel Rezende Paiva que autorizou a utilização deste laboratório e me deu todo o suporte necessário, além de me ajudar bastante, tirando as minhas dúvidas na identificação dos fragmentos de microssatélites, na utilização de vários programas e na análise e interpretação de vários resultados. Especialmente, agradeço à Elizabete Cristina da Silva que me ajudou no LGA da Embrapa. Agradeço pelas conversas e pela amizade construída, pela troca de vários emails perguntando sobre os programas e por sempre responder todos e sanar as minhas dúvidas. Obrigada, Bete, obrigada mesmo, sem você acho que teria sido muito mais difícil. A todos os parceiros e colaboradores dessa pesquisa que forneceram informações e amostras de Stenella longirostris: Dra. Ana Carolina de Oliveira Meirelles, coordenadora do Programa de Mamíferos Marinhos da Associação de Pesquisa e Preservação de Ecossistemas Aquáticos (Aquasis), Sr. Lupércio Barbosa da Organização Consciência Ambiental (Instituto ORCA), Dr. Ignácio Benites Moreno da Universidade Federal do Rio Grande do Sul e Dr. Eduardo Resende Secchi, por acreditarem no projeto, sem os quais esta pesquisa não seria possível. A todos do Projeto Golfinho Rotador, especialmente ao Dr. José Martins da Silva-Jr (ICMBio/CMA) por viabilizarem coletas de pele de golfinhos-rotadores no Arquipélago de Fernando de Noronha, pela contribuição e troca de informações. Aos amigos da minha turma de mestrado, “turminha”, a menor do PPGBT, Beraba (Poliana), Marina, Fabiana e Kamila, muito obrigada pela amizade, extensas conversas, trocas de informações e ajudas em várias coisas do projeto. À Thais de Assis Volpi pela amizade, parceria em vários procedimentos laboratoriais, troca de informações e ajuda em vários aspectos. À Geórgia, Izabela, Lougan e Júnio pela disponibilidade, conversas e troca de informações. À FAPES pela bolsa de auxílio do mestrado, sem a qual seria muito difícil continuar na área acadêmica. À minha família, em especial, pelo apoio, companheirismo, carinho e amor incondicional. Muito obrigada pelo incentivo e pelos esforços sem medidas na minha educação e crescimento intelectual. Eu sou eternamente grata a todos vocês. Ao meu namorado, Rafael Pereira de Moraes, pela atenção, carinho, apoio e compreensão, que me ajudaram a seguir em frente. A Deus, principalmente, por ter iluminado a minha mente e me proporcionado sabedoria para enfrentar os momentos difíceis, por ter me dado forças para não desistir e continuar sempre em busca dos meus objetivos. Obrigada a todos! Nenhum problema pode ser resolvido pelo mesmo estado de consciência que o gerou. É preciso ir bem mais longe do que isso. Albert Einstein SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 15 2. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 22 2.1 Objetivo geral.................................................................................................................. 22 2.2 Objetivos específicos ...................................................................................................... 22 3. MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................................. 23 3.1 Coleta e armazenamento das amostras ........................................................................... 23 3.2 Extração e quantificação de DNA................................................................................... 27 3.3 PCR com primers microssatélites ................................................................................... 27 3.4 Diversidade genética ....................................................................................................... 29 3.5 Estruturação genética populacional ................................................................................ 30 4. RESULTADOS .................................................................................................................... 32 4.1 Amplificação e polimorfismo dos microssatélites .......................................................... 32 4.2 Amostragem .................................................................................................................... 32 4.3 Diversidade genética ....................................................................................................... 33 4.4 Estruturação genética populacional ................................................................................ 36 5. DISCUSSÃO ........................................................................................................................ 41 5.1 Diversidade Genética ...................................................................................................... 41 5.2 Desvios do EHW............................................................................................................. 42 5.3 Estruturação genética populacional ................................................................................ 44 6. CONCLUSÕES .................................................................................................................... 48 7. REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 49 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Número de amostras coletadas, pontos de coleta, tipo de material e método de coleta......................................................................................................................................... 23 Tabela 2. Locos, sequências dos primers, tamanho (pb), tipo de marcação fluorescente (Marc), temperatura de anelamento (T) e multiplex (M).. ....................................................... 28 Tabela 3. Diversidade genética de golfinhos-rotadores do litoral brasileiro para sete locos microssatélites .......................................................................................................................... 33 Tabela 4. Teste do desvio das frequências alélicas do esperado em EHW, e número de indivíduos (n) por localidade. ................................................................................................... 35 Tabela 5. Diversidade genética de golfinhos-rotadores do litoral brasileiro amostrados em cada localidade para sete locos microssatélites ....................................................................... 35 Tabela 6. Análise de Variância Molecular (AMOVA) para as duas unidades populacionais indicadas pelo programa Structure. .......................................................................................... 38 Tabela 7. Diversidade genética de golfinhos-rotadores das duas unidades populacionais do litoral brasileiro para sete locos microssatélites ....................................................................... 40 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Foto de Stenella longirostris .................................................................................... 15 Figura 2. Mapa de distribuição geográfica das subespécies de Stenella longirostris (GALVER, 2002). .................................................................................................................... 16 Figura 3. Mapa com as localidades do litoral brasileiro onde foram obtidas as amostras de Stenella longirostris.................................................................................................................. 24 Figura 4. Peças (esponja abrasiva autoclavada, cabo de madeira encapado com dedo de luva de látex e presilha plástica) para montagem do amostrador utilizado na raspagem de pele dos golfinhos ................................................................................................................................... 25 Figura 5. Método de coleta de pele de golfinhos-rotadores .................................................... 26 Figura 6. Esponja fixada no amostrador contendo amostra de pele de um golfinho-rotador, classificada como (++) ............................................................................................................ 26 Figura 7. Estimativa do melhor K pela estatística DeltaK ..................................................... 36 Figura 8. Número de clusters encontrados para golfinhos-rotadores do litoral brasileiro ...... 37 Figura 9. Análise de Coordenadas Principais (PCoA) realizada a partir de uma tabela de frequências alélicas baseada em sete locos microssatélites de golfinhos-rotadores do litoral brasileiro ................................................................................................................................... 38 Figura 10. Maiores correntes superficiais oceânicas (C.) ....................................................... 47 ANEXOS Anexo 1. Protocolo de extração com a resina Chelex a 5% ..................................................... 64 Anexo 2. Protocolo de extração com solução salina adaptado por David Vieites - U.C. Berkeley .................................................................................................................................... 65 Anexo 3. Frequências alélicas para cada loco microssatélite................................................... 67 ABREVIATURAS E SIGLAS PCoA: Análise de Coordenadas Principais; AMOVA: Analyses of Molecular Variance (Análise de Variância Molecular); Dntp: Desoxirribonucleotídeo5‟ fosfato; F(Null): frequência de alelos nulos; EHW: Equilíbrio de Hardy-Weinberg; HWE: Hardy-Weinberg Equilibrium; MCMC: Markov Chain Monte Carlo; MiliQ: sistema de purificação integral de água; Pb: pares de bases; PCR: Polymerase Chain Reaction (Reação em cadeia da Polimerase); PIC: Polymorphic Information Content (Conteúdo de Informação Polimórfica); RNase: ribonuclease; SMM: Stepwise Mutation Model (Modelo Mutacional passo-a-passo); Taq: Thermophillus aquaticus; TBE: Tampão tris-borato EDTA; TPM: Two-Phased Model (Modelo Mutacional Bifásico); RESUMO Golfinhos-rotadores, de distribuição pantropical, apresentam estruturação genética em unidades populacionais do Oceano Pacífico Norte, entretanto, pouco se sabe sobre tais processos em unidades populacionais do Oceano Atlântico Sul. Fatores históricos, ambientais, comportamentais e estrutura social influenciam na estrutura populacional desta espécie. A fim de avaliar a existência de estruturação genética em grupos de golfinhos-rotadores do litoral brasileiro, 414 amostras foram testadas com dez locos microssatélites. Avaliando-se 223 indivíduos e sete locos polimórficos não ligados, os golfinhos-rotadores do litoral brasileiro apresentaram valores altos de heterozigosidade observada (Ho=0.9724) e esperada (He=0.8130), e diversidade genética (Dg=0.812). Nenhuma das localidades amostradas apresentou valores significativos de coeficiente de endocruzamento, já os desvios do EHW foram significativos para os indivíduos do Arquipélago de Fernando de Noronha e Rio de Janeiro. A análise de cluster bayesiana e a Análise de Coordenadas Principais (PCoA) revelaram a separação genética dos golfinhos-rotadores do litoral brasileiro em duas unidades populacionais. A AMOVA (FST=2.16; P≤0,05.) e os índices de diferenciação genética (FST: 0.0206; RST: 0.0111; P≤0,001) corroboraram tais resultados com valores significativos. As duas unidades populacionais apresentaram diversidade genética (UP1: Dg=0.7902; UP2: Dg=0.7796), heterozigosidade observada (UP1: Ho=0.9615; UP2: Ho=0.9833) e esperada (UP1: He=0.8211; UP2: He =0.7934), e riqueza alélica (UP1: Ra=13.1; UP2: Ra=8.5) altas. Ambas as unidades de população apresentaram desvios significativos do EHW em praticamente todos os locos. Indivíduos amostrados vivos no Arquipélago de Fernando de Noronha foram agrupados em duas diferentes unidades de população corroborando a idéia da existência de duas distintas unidades de população de S. longirostris neste arquipélago, provavelmente uma residente e outra formada por transientes. A estruturação identificada agrupou indivíduos amostrados em diferentes áreas do litoral brasileiro, sugerindo possível fluxo gênico mesmo entre regiões distantes. Palavras-chave: cetáceos; diversidade genética; estruturação populacional; microssatélites. ABSTRACT Spinner dolphins, pantropically distributed, exhibit genetic structuration in population units of the North Pacific Ocean, however little is known about such processes in South Atlantic Ocean populations units. Historical, environmental and behavioral factors and social structure influence this species population structure. In order to assess the existence of genetic structure in spinner dolphins groups of the Brazilian coastline 414 samples were tested with ten microsatellite loci. Evaluating 223 individuals and seven polymorphic loci, not linked, the Brazilian coastline spinner dolphins presented high values of observed heterozygosity (Ho=0. 9724) and expected (He=0.8130), and genetic diversity (Dg=0.812). The bayesian cluster analysis and Principal Coordinate Analysis (PCoA) revealed the genetic structuring of spinner dolphins of the Brazilian coastline in two population units. AMOVA (FST= 2.16; P≤0.05) and genetic differentiation index (FST: 0.0198; RST: 0.0165; P≤0.001) confirmed such results with significant values. The two population units show high genetic diversity (PU1: Dg=0.793601; PU2: Dg=0.7832), observed heterozygosity (PU1: Ho=0.9616; PU2: Ho=0.9805) and expected (PU1: He=0.8202; PU2: He =0.7942), and allelic richness (PU1: Ra=13.1; PU2: Ra=8. 5). Both population units showed significant deviations of HWE in virtually all loci. Sampled individuals alive in the Archipelago of Fernando de Noronha were grouped in two different population units corroborating the idea of the existence of two separate population units of S. longirostris in this archipelago, probably a resident and another formed by transients. The structuration identified grouped individuals sampled in different areas of the Brazilian coastline, suggesting possible gene flow even among distant regions. Keywords: cetaceans; genetic diversity; population structuration; microsatellites. 15 1. INTRODUÇÃO Stenella longirostris, conhecido popularmente como golfinho-rotador, é uma espécie classificada como pertencente à ordem Cetacea, subordem Odontocetti, família Delphinidae e gênero Stenella (GRAY, 1828) (Fig. 1). Estes golfinhos caracterizam-se pela notável habilidade de realizar altos saltos fora da água com várias rotações em torno do próprio eixo corporal (FISH et al., 2006), até 14 vezes longitudinalmente (PERRIN et al., 2002). Figura 1. Foto de Stenella longirostris. S. longirostris é um cetáceo de pequeno porte, cujo comprimento em adultos sexualmente maduros varia de 129 a 235 cm e o peso varia de 23 a 78 Kg. Seu padrão de coloração é constituído por tons de cinza, mais escuro no dorso clareando em direção ao ventre, com algumas exceções como, por exemplo, na subespécie S. l. longirostris que apresenta uma faixa de coloração negra da região dos olhos até a base da nadadeira peitoral e nas subespécies S. l. orientalis e S. l. centroamericana no extremo leste Pacífico que apresentam uma sobreposição escura no dorso. A idade máxima que os golfinhos-rotadores podem atingir é de 20 anos (NORRIS e DOHL, 1980) e seu período de gestação é de cerca de 10 meses e ocorre de três em três anos. Os machos atingem a maturidade sexual entre sete e dez anos e as fêmeas com quatro a sete 16 anos de idade em média (PERRIN, 1998). O sistema de acasalamento envolve múltiplos acasalamentos de machos com a mesma fêmea, tendência à estrutura populacional poliândrica (PERRIN, 1998). São animais que apresentam distribuição pantropical sendo encontrados nos oceanos Atlântico, Pacífico e Índico e menos frequentemente em águas quentes temperadas (Fig. 2). No Brasil a distribuição da espécie abrange quase toda a extensão do litoral, atingindo 30°S (MORENO et al., 2005). Figura 2. Mapa de distribuição geográfica das subespécies de Stenella longirostris (GALVER, 2002). A = S. l. longirostris, B = S. l. orientalis, C = S. l. centroamericana, D = S. l. roseiventris. Devido à sua ampla distribuição, esta espécie apresenta uma notável variação intraespecífica em vários caracteres morfológicos e parâmetros ecológicos. Quatro subespécies são conhecidas: Stenella longirostris orientalis, uma forma morfologicamente distinta endêmica do extremo leste do Oceano Pacífico; Stenella longirostris centroamericana, cuja distribuição abrange águas costeiras do Oceano Pacífico na América Central; Stenella longirostris roseiventris, consideravelmente pequena (140 cm), observada em águas do Golfo da Tailândia, Oeste da Indonésia e Sul da China, e Stenella longirostris longirostris encontrada nos Oceanos Índico, Atlântico e Pacífico (PERRIN, 1989; PERRIN, 1990) (Fig. 2). 17 Geralmente ocorrem em grandes grupos, longe da costa ou próximos a ilhas oceânicas de origem vulcânica, tais como as do Arquipélago do Hawaii, do Arquipélago de Fernando de Noronha e do Arquipélago da Polinésia Francesa (NORRIS et al.,1994). Estima-se a existência de mais de meio milhão de golfinhos-rotadores em todo o mundo (GALVER, 2002; HAMMOND et al., 2008). Estes cetáceos apresentam baixo custo energético para locomoção, podem percorrer grandes distâncias (de 300 a 1000 km) e são capazes de se dispersar entre ilhas e atóis (MARTIN et al., 1990; WURSIG et al.,1994 b; WELLS e GANNON, 2005). Além disso, geralmente apresentam um modelo de organização social de “fissão-fusão” com a formação diária de grupos com mais de 1000 indivíduos (NORRIS et al., 1994). Estudos de fotoidentificação e observação comportamental nos arquipélagos onde estes golfinhos ocorrem revelaram a exibição de um ciclo diário, em que descansam e socializam próximo às ilhas, bancos e atóis durante o dia e no anoitecer se movem para longe da costa, em águas frias e profundas onde se alimentam de peixes, lulas e camarões (POOLE, 1995; KARCZMARSKI et al., 2005; SILVA e SILVA JR, 2009). No Arquipélago de Fernando de Noronha são observados grandes grupos de golfinhos-rotadores com uma média de 600 indivíduos por dia, sendo o local considerado refúgio natural da espécie no Brasil (SILVA JR, 2005; SILVA e SILVA JR, 2009). No atol de Midway, no Havaí, foi registrada a ocorrência de um modelo diferente de organização social, com uma população de cerca de 200 indivíduos com forte fidelidade geográfica (KARCZMARSKI et al., 2005). A despeito de sua distribuição pantropical e grupos com grande quantidade de indivíduos é uma espécie categorizada como “DD” (Deficiente de Dados) no Livro Vermelho da Fauna Brasileira Ameaçada de Extinção (CHIARELLO et al., 2008), na RedList da IUCN (HAMMOND et al., 2009) e no Plano de Ação Nacional para Conservação de Pequenos Cetáceos do ICMBio (SILVA-JR e BARRETO, 2011). De acordo com o Plano de Ação de Mamíferos Aquáticos do Brasil (2011), das 41espécies de cetáceos registradas em águas jurisdicionais Brasileiras 56% são classificadas como dados deficientes (DD). Pesquisas genéticas com marcadores moleculares têm sido realizadas com várias espécies animais e têm contribuído para aumentar a quantidade de informações sobre a biologia básica destas espécies e assim auxiliar na elaboração de estratégias de conservação (ANDREWS et al., 2010; CORBIS, 2011). Entretanto, para a maioria das espécies de cetáceos, informações sobre diversidade genética, dinâmica e estruturação populacional ainda 18 são escassas, principalmente por se trataram de organismos marinhos e com notável capacidade de deslocamento. Os marcadores moleculares são regiões do genoma ou segmentos específicos de DNA que podem ou não fazer parte de um gene. Possuem alto nível de polimorfismo, geralmente são neutros a efeitos fenotípicos, são codominantes promovendo maior quantidade de informação genética por loco, detectam grande número de locos não ligados e são de herança simples (MATIOLI, 2001). Dentre estes, os microssatélites e as sequências de DNA mitocondrial, regiões do genoma de rápida evolução, têm sido particularmente úteis em estudos populacionais de cetáceos em geral (CABALLERO et al., 2011; MESNICK et al., 2011; AMARAL et al., 2012). Os microssatélites ou SSRs (Simple Sequence Repeats) são regiões do DNA que apresentam sequências simples repetidas lado a lado, são codominantes e podem apresentar um alto grau de polimorfismo identificando diversos alelos, mesmo em espécies ameaçadas e em pequenas populações (VOWLES e AMOS, 2004). Possuem alta heterosigosidade, elevado conteúdo informativo e são de herança biparental, assim podem ser usados para examinar o fluxo de genes mediado por machos e fêmeas (OREMUS, 2008). Suas limitações provêm da ocorrência de alelos idênticos (homoplasia) e mutações nas regiões flanqueadoras, responsáveis pela presença de alelos nulos ou silenciosos que não são amplificados na reação de PCR, dificultando, muitas vezes, a identificação dos heterozigotos (JARNE e LAGODA, 1996). Apesar disso, os microssatélites geram uma grande quantidade de dados, apresentam ampla distribuição no genoma e são identificados eficazmente, representando uma ótima ferramenta em estudos de variabilidade genética de populações e estruturação populacional de cetáceos (ROSEL et al., 1994; BAKER e PALUMBI, 1995; GARCÍA-MARTÍNEZ et al., 1999). Dentro do gênero Stenella, análises de locos microssatélites e da região controle do DNA mitocondrial (D-loop) do golfinho-pintado-pantropical (Stenella attenuata) nas águas do Havaí apontaram diferenciação genética entre os golfinhos das quatro regiões de ilhas analisadas e sugeriu que golfinhos perto das ilhas de Kaua„i/Ni„ihau são transientes e em um número muito pequeno (COURBIS, 2011). Os autores indicam que estas unidades de populações de S. attenuata poderiam ser tratadas como diferentes stocks, do mesmo modo como o são as unidades de população de golfinhos-rotadores e golfinhos-nariz-de-garrafa encontradas na mesma região (COURBIS, 2011). 19 Dentre os cetáceos muitas espécies de golfinhos apresentam estruturação genética populacional apesar da presença de poucas barreiras geográficas limitantes ao deslocamento (HOELZEL et al., 2002a). Para estes animais, temperatura da superfície da água, especializações comportamentais aos locais de recursos, estrutura social, e processos históricos são considerados fatores determinantes nos padrões de estruturação populacional (HOELZEL, 1998; HOELZEL et al., 2002a). Estes fatores combinados resultam em um “trade-off” entre adaptação local e minimização de endogamia (HEWITT e BUTLIN, 1997). Um dos exemplos documentados é o encontrado em baleias-orcas (Orcinus orca) do norte do Oceano Pacífico Oriental (BIGG et al.,1990). Suas duas formas simpátricas, as “comedoras de peixes” e as “comedoras de mamíferos” são geneticamente isoladas entre si, a nível mitocondrial e nuclear, além de exibirem diferenças no tamanho e estabilidade dos grupos, nos tipos de presas consumidas e nos padrões de dispersão (STEVENS et al., 1989; HOELZEL e DOVER, 1991; HOELZEL et al., 1998a; BARRETT-LENNARD, 2000). Pesquisas com DNA mitocondrial de golfinhos listrados (S. coeruleoalba) revelaram a presença de duas unidades de população geneticamente distintas no Mar Mediterrâneo e no Oceano Atlântico (GARCÍA- MARTÍNEZ et al.,1999). Diferenciação genética também foi reportada com locos microssatélites para esta mesma espécie entre unidades de população dos oceanos Adriático e Tirreno e entre unidades de população costeiras e não costeiras do Oceano Tirreno (GASPARI et al.,2007). No Oceano Pacífico Leste sequências da região controle do DNA mitocondrial e genótipos de microssatélites revelaram que dos quatro morfótipos endêmicos da região (Rotador do Leste, Rotador Whitebellye, Rotador Centro-Americano e Rotador Tres Marias) a única unidade de população geneticamente divergente era a do morfótipo Rotador CentroAmericano (GALVER, 2002). Nas ilhas da Polinésia Francesa genótipos de microssatélites e sequências da região controle do DNA mitocondrial de golfinhos-rotadores demostraram nenhuma evidência de efeito gargalo e diferenciação genética significativa entre as unidades de população das ilhas, indicativo de fluxo gênico restrito entre comunidades vizinhas mesmo que algum movimento individual tenha sido documentado (OREMUS et al., 2007). Os autores sugerem que este padrão genético é resultado de uma estrutura de metapopulação baseada em numerosas comunidades insulares conectadas evolutivamente através de fluxo gênico de machos e fêmeas (OREMUS et al., 2007). A região controle do DNA mitocondrial e locos microssatélites de S. longirostris do Arquipélago do Havaí demonstraram que estruturas sociais e genéticas são flexíveis entre 20 estes golfinhos e podem variar em resposta a diferentes hábitats em escalas geográficas relativamente pequenas (ANDREWS et al., 2010). Identificou-se baixa estruturação genética entre os indivíduos das Ilhas Havaianas e uma tendência para golfinhos associados a pequenas ilhas e atóis apresentarem baixos níveis de diferenciação e diversidade genética, além de forte isolamento genético dos golfinhos da ilha do Havaí (Costa Kona), fato atribuído à presença de muitos sítios de descanso e de alimentação o que reduz a dispersão, e logo o fluxo gênico com as ilhas adjacente (ANDREWS et al., 2010). No Oceano Atlântico Sul, especificamente no litoral do Brasil, os golfinhos-rotadores têm sido pesquisados quanto à diversidade genética e estruturação genética populacional. Golfinhos-rotadores do Arquipélago de Fernando de Noronha foram analisados temporalmente e espacialmente, com o uso de marcadores microssatélites espécie-específicos, e verificou-se a presença de apenas uma unidade de população (FARRO, 2006). Após este estudo, surgiu a necessidade de incrementar o número amostral e de utilizar outras regiões do genoma a fim de investigar melhor este padrão populacional. Com o aumento do número amostral e a utilização da região controle do DNA mitocondrial (D-loop), verificou-se que: os golfinhos-rotadores deste arquipélago não apresentaram estruturação populacional temporal com base nos anos de coleta das amostras (2004, 2006 e 2009); que estão significativamente distantes de outras populações de S. longirostris do Oceano Pacífico não compartilhando nenhum haplótipo; que apresentam diversidade haplotípica e nucleotídica relativamente baixas, quando comparada com as já reportadas para a espécie ou mesmo para outros delfinídeos; que provavelmente estão em expansão populacional; e que há, pelo menos, duas unidades de população de Stenella longirostris no litoral próximo a este Arquipélago (FARIA, 2010). Posteriormente, a questão era verificar se este padrão se manteria caso fossem analisadas conjuntamente amostras de outras localidades do litoral brasileiro. Assim, além das amostras do Arquipélago de Fernando de Noronha, foram avaliadas amostras de oito localidades. Para esta análise utilizou-se duas regiões do DNA mitocondrial, além da região controle (D-loop), a região citocromo oxidase subunidade 1 (COI) (VOLPI, 2012). Esta pesquisa revelou baixa diversidade genética; presença de quatro grupos genéticos com diferenciação genética significativa entre si; e baixo fluxo gênico entre o grupo do Arquipélago de Fernando de Noronha (Insular) e os demais grupos (Não-insulares); o que pode ser atribuído à fidelidade de sítio dos indivíduos insulares (VOLPI, 2012). Além disso, a rede de haplótipos resultante de uma análise comparativa das sequências do DNA mitocondrial com indivíduos de outras localidades do mundo revelou que unidades 21 de população brasileiras foram intermediadas por unidades de população de outros oceanos (Índico e Pacífico) (VOLPI, 2012). Sugere-se que o fluxo gênico entre estas unidades de população possa ser determinado por fatores ecológicos e comportamentais (VOLPI, 2012). No entanto, para compreender melhor a dinâmica populacional e o padrão de distribuição da espécie no litoral brasileiro, ainda são necessárias análises complementares com outras regiões do genoma da espécie. Deste modo, a fim de dar continuidade aos estudos com esta espécie de golfinhos no litoral brasileiro e aumentar as informações genéticas sobre esta espécie no Oceano Atlântico Sul, a proposta deste trabalho foi realizar um estudo de estruturação genética de golfinhosrotadores do litoral brasileiro a partir de marcadores moleculares microssatélites. Assim, esta pesquisa ampliou o número de regiões do genoma de S. longirostris até agora analisadas no sul do Oceano Atlântico e contribuiu para a melhor compreensão da dinâmica populacional e do padrão de distribuição da espécie no litoral brasileiro. 22 2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral: Avaliar a existência de estrutura genética em grupos de golfinhos-rotadores (Stenella longirostris) amostrados ao longo do litoral brasileiro. 2.2 Objetivos específicos: Genotipar golfinhos-rotadores amostrados em diferentes localidades do Brasil a partir de marcadores microssatélites; Determinar heterozigosidades observada e esperada, diversidade e frequências alélicas; Comparar a diversidade genética encontrada nos indivíduos das diferentes localizações geográficas do Brasil; Testar padrões de estruturação entre os indivíduos amostrados no litoral brasileiro. 23 3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Coleta e armazenamento das amostras Para a análise genética dos golfinhos-rotadores foram utilizadas amostras de tecido de diferentes localidades do litoral brasileiro (Fig. 3, Tab. 1). Tais amostras foram obtidas por meio do método de raspagem de pele (FARRO et al., 2008) ou biópsia (balestra) (KRUTZEN et al., 2002) de animais vivos, ou ainda, de animais mortos encalhados encontrados nas praias. As amostras do Rio de Janeiro, Paraná e Santa Catarina foram obtidas por meio de balestra e totalizaram 47 amostras. Destas, 26 são do Rio de Janeiro, cinco do Paraná, cinco de Santa Catarina e uma de São Paulo. Tabela 1. Número de amostras coletadas, pontos de coleta, tipo de material e método de coleta. Localidade Material Coleta Quantidade Ceará (CE) Músculo Encalhe 02 Ceará (CE) Coração Encalhe 02 NI Encalhe 01 Pernambuco (PE) Fígado Encalhe 02 Arquipélago de Fernando de Noronha (FN) Fígado Encalhe 07 Músculo Encalhe 05 NI Encalhe 09 Pele Raspagem 346 Espírito Santo (ES) Fígado Encalhe 03 Rio de Janeiro (RJ) Pele Balestra 25 Rio de Janeiro (RJ) Músculo Balestra 01 São Paulo (SP) Pele Balestra 01 Paraná (PR) Pele Balestra 05 Santa Catarina (SC) Pele Balestra 05 Rio Grande do Norte (RN) TOTAL Legenda: NI: Não Identificado. 414 24 Figura 3. Mapa com as localidades do litoral brasileiro onde foram obtidas as amostras de Stenella longirostris. 25 Das 367 amostras do Arquipélago de Fernando de Noronha 21 foram provenientes de animais encontrados mortos encalhados nas praias, as demais foram obtidas a partir de animais vivos por meio do método de raspagem de pele. As coletas de pele foram realizadas nos anos de 2004 (6), 2006 (81), 2009 (99) e 2012 (160) por Farro e colaboradores em parceria com o Centro de Mamíferos Aquáticos / ICMBio e Projeto Golfinho Rotador, com patrocínio da Petrobrás Ambiental. No método de coleta por raspagem utilizam-se esponjas compostas de fibra sintética e material abrasivo com tamanho de 8 X 8 cm fixadas em um mastro de madeira (amostrador) de 130cm de comprimento (FARRO et al.,2008) (Figs. 4 e 5). Neste método um dos pesquisadores com o amostrador em mãos fica deitado de bruços na proa de uma embarcação de pequeno porte, inflável ou lancha, e, com a aproximação do golfinho, esfrega a esponja no dorso ou no flanco do animal, quando este se aproxima da proa da embarcação (Fig. 5). Logo após o contato da esponja com o dorso do animal, ainda na embarcação, removese a amostra de pele do amostrador e a armazena em um frasco contendo álcool 70% (Fig. 6). As amostras retiradas dos amostradores são classificadas em três categorias: (--) não apresentava material epidérmico visível na esponja; (+-) pele visível na esponja; (++) grande quantidade de pele visível. Figura 4. Peças (esponja abrasiva autoclavada, cabo de madeira encapado com dedo de luva de látex e presilha plástica) para montagem do amostrador utilizado na raspagem de pele dos golfinhos. 26 Figura 5. Método de coleta de pele de golfinhos-rotadores. Figura 6. Esponja fixada no amostrador contendo amostra de pele de um golfinho-rotador, classificada como (++). As licenças para transporte e manipulação do material biológico foram concedidas pelo Sistema de autorização e informação em Biodiversidade (SISBIO) / ICMBio – IBAMA. 27 Os procedimentos laboratoriais e análises foram desenvolvidos no Laboratório de Genética e Conservação Animal do Centro Universitário Norte do Espírito Santo (CEUNES), Universidade Federal do Espírito Santo (UFES), São Mateus, ES. Em particular, os fragmentos de microssatélites foram identificados no Departamento de Genética do Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, SP, e no Laboratório de Genética Animal (LGA) da Embrapa, Brasília, DF. 3.2 Extração e quantificação de DNA Dois protocolos de extração de DNA foram utilizados a fim de se obter quantidade suficiente de DNA, o primeiro a partir de solução salina (BRUFORD et al., 1992, adaptado por David Vieites) (Anexo 2), e o segundo com resina Chelex a 5% (SIGMA) (Anexo 3). Do total das amostras, 32 amostras de vísceras (coração e fígado) e músculo foram submetidas ao primeiro protocolo; e 382 amostras de pele foram extraídas com o segundo protocolo. O segundo método foi adotado para amostras que continham pequena quantidade de pele, uma vez que requer menor quantidade de tecido e promove um maior volume final de DNA. Em seguida as amostras de DNA foram quantificadas em espectrofotômetro (NanoDrop – ND-2000, Uniscience), utilizando-se 2 μL das soluções a fim de se obter a quantidade de DNA, em nanogramas, presente em 1 μL de solução final resultante da extração. 3.3 PCR com primers microssatélites As amostras foram genotipadas com a utilização de dez locos microssatélites publicados (Tab. 2). Destes, sete são espécie-específicos e três foram desenvolvidos para outras espécies de cetáceos. Estes primers foram diluídos em água miliQ previamente autoclavada para uma concentração de 100μM, consistindo em uma solução estoque. A partir desta, uma nova diluição foi realizada para os primers ficarem em uma concentração final de 10μM para uso. Na amplificação dos microssatélites, foi utilizado o Kit para PCR multiplex da Qiagen (contendo Hotstart Taq DNA Polimerase, Tampão para PCR multiplex com MgCl2, mix de dNTP, água RNase-free e QSolution), 1,5 μLde DNA e 0,1 μM de cada primer para um volume final de 5μL. Para otimizar o tempo de análise no laboratório foram realizados PCRs multiplex, nas quais mais de um loco é amplificado numa única reação. 28 As condições para amplificação foram: desnaturação a 95°C por 15 min, 35 ciclos para desnaturação a 94°C por 4 min, temperatura de anelamento por 1 min e 30 seg, extensão a 72°C por 1 min e 30 seg, e uma etapa de extensão final a 72°C por 15 minutos. Em todas as amplificações realizadas foi utilizado um controle negativo de PCR para descartar possíveis contaminações nas reações. Tabela 2. Locos, sequências dos primers, tamanho (pb), tipo de marcação fluorescente (Marc), temperatura de anelamento (T) e multiplex (M). Sequência primer 5’-3’ pb *Marc T (ºC) M SD8 TGGCCGTTATAAATAGAGC GACAACAGTTTGGCAGTG 185-218 F 52ºC A SL1-25 TTGATTTTCTGACTTCTTGGG CTCCGATATTGCCTTTACC 109-125 F 54ºC B CATCTGTTCTTTGAATAGAGG ACCCATTCTGGTTCACC 138-168 H 52ºC C SL9-69 TTCCAAACATACCCCTGCC ACTAGATGCCACTTGCACC 109-125 H 54ºC B SL10-26 GCTATGTTATATCTATCTTCC TTAGGGCATTAATTTGAGTGC 128-172 H 52ºC A CGTCAAACTCCATCAAGACATC ATCTCCACCACAAGACACCAC 218-252 F 52ºC D SLO1 CAAACCAAAAGCAAACACACAC CATCTCTATCAGCCATGTCCAA 140-166 F 54ºC B 415-416 GTTCCTTTCCTTACA ATCAATGTTTGTCAA 222-234 F 50ºC E EV1 CCCTGCTCCCCATI'CTC ATAAACTCTAATACACTTCCTCCAAC 115-197 F 52ºC F EV94 ATCCTATTGGTCCTTTTCTGC AATAGATAGTGATGATGATTCACACC 198-261 H 52ºC D Locus 1 1 1 SL8-49 1 1 2 SLO15 2 3 4 4 * F = 6‟FAM; H= HEX. 1 GALVER, 2002, 2FARRO, 2006, 3 AMOS et al., (1993), 4VALESCCHI; AMOS (1996). Os produtos de amplificação dos microssatélites foram desnaturados com um mix contendo um padrão interno ROX e formamida HIDI a 95°C por cinco minutos e imediatamente deixados no gelo por cinco minutos e submetidos à eletroforese capilar no sequenciador automático de DNA do modelo ABI PRISM 3730 (Applied Biosystems). Para essa análise, as amostras foram distribuídas em cinco placas de 96 poços, com quatro amostras sendo repetidas em todas as corridas para controle do tamanho dos fragmentos de um determinado loco entre as diferentes corridas. Depois de finalizar a eletroforese capilar, os alelos dos locos microssatélites foram identificados com o software GeneMapper v.5.0(Applied Biosystems) de acordo com a 29 intensidade dos picos do eletroferograma. Os indivíduos que apresentaram os dois alelos com igual tamanho de pares de bases tiveram sua genotipagem repetida a fim de certificar sua homozigosidade. O software FlexiBin v. 2.0 (AMOS et al., 2006) foi utilizado para determinação das classes alélicas que foram utilizados para geração dos arquivos de entrada para os programas estatísticos. O programa GenAlex v. 6.5 (PEAKALL e SMOUSE, 2006) foi utilizado para converter a planilha de dados para o arquivo de entrada requerido por cada programa. A probabilidade de não-exclusão para identidade dos indivíduos foi estimada utilizando o software Cervus v.3.0.3 (KALINOWSKI et al., 2007). Os genótipos dos indivíduos avaliados foram comparados para os locos de microssatélites com o programa Mstools v. 3.1 (PARK, 2001) a fim de se verificar a presença de genótipos idênticos. Das amostras idênticas, apenas uma foi mantida para as análises posteriores. O desequilíbrio de ligação entre os locos foi verificado com o programa GENEPOP on the Web (http://wbiomed.curtin.edu.au/genepop) e os desvios do Equilíbrio de HardyWeinberg foram testados por meio do software Arlequin v.3.11 (EXCOFFIER et al., 2005). Os locos também foram testados quanto à presença de alelos nulos, abandono de alelos e erros devido à presença de picos stutter utilizando-se o programa Microchecker v.2.2.0.3 (VAN OOSTERHOUT et al., 2004), com correção de Bonferroni. 3.4 Diversidade genética Somente os locos polimórficos foram utilizados nas análises de diversidade genética. Para as análises intrapopulacionais foi calculado o número total de alelos (K); número médio de alelos (Nam); número de alelos privados (Nap); média da riqueza alélica (número de alelos independente do tamanho da amostra (Ra); heterozigosidade observada (Ho) e esperada (He); diversidade genética (Dg) e coeficiente de endocruzamento (FIS) com os programas Fstat v.2.9.3.2 (GOUDET, 2001) e Arlequin v.3.11 (EXCOFFIER et al.,2005). Para verificar eventos de gargalo populacional passado ou recente um teste de ocorrência de Bottleneck (efeito gargalo) foi realizado utilizando o software Bottleneck v. 1.2.02 (CORNUET e LUIKART, 1996), programa específico para detectar reduções recentes no tamanho efetivo da população a partir de frequências alélicas. Neste programa considerouse o cálculo de Wilcoxon para excessos de heterozigotos que apresenta alto poder estatístico (PIRY et al., 1999). 30 As corridas foram realizadas assumindo-se o modelo mutacional passo-a-passo (SMM) e o modelo mutacional bifásico (TPM; variação = 30, 70% modelo mutacional gradual, 10000 interações). Valores de P foram considerados significativos no nível de 0,05 (P≤0,05). Os modelos mutacionais SMM e TPM são os mais apropriados para microssatélites (LUIKART; CORNUET, 1998), com o modelo TPM fornecendo dados mais realísticos dos eventos mutacionais em locos microssatélites (DI RIENZO et al., 1994; PIRY et al., 1999). 3.5 Estruturação genética populacional Para determinar a provável estrutura populacional dos golfinhos-rotadores do litoral brasileiro foi realizada uma análise de cluster bayesiana a fim de se estimar o número de populações mais prováveis (K) a partir dos dados dos genótipos dos sete microssatélites e nove locais de coleta utilizando o software Structure v.2.3.2 (PRITCHARD et al., 2000). Este programa detecta facilmente duas a quatro populações altamente diferenciadas utilizando os logaritmos das probabilidades dos dados (ln P (D)) para inferir o melhor K com uma estatística ad hoc denominada DeltaK, a qual baseia-se na taxa de mudança do logaritmo da probabilidade dos dados entre sucessivos valores de K (EVANNO et al., 2005). O comprimento burn-in foi fixado em 104 passos, seguido de 500.000 repetições de Cadeia de Markov e Simulação Monte Carlo (MCMC). Dez execuções independentes foram realizadas para cada valor de K variando entre um e dez para testar a consistência das estimativas de P(X/K). Análises adicionais foram realizadas para testar a consistência dos resultados (100000 de burn-in e 500000 de MCMC). Os testes foram aplicados com base no admixture model (modelo de miscigenação) com as frequências alélicas correlacionadas (FALUSH et al., 2003), uma vez que espera-se que frequências alélicas em diferentes populações sejam susceptíveis de serem similares, devido a migração ou ancestrais compartilhados. A partir dos logaritmos das probabilidades dos dados (Ln P (D)) obtidos com o programa Structure para as duas análises, foi estimado o melhor K com uma estatística ad hoc denominada DeltaK, a qual baseia-se na taxa de mudança do logaritmo da probabilidade dos dados entre sucessivos valores de K (EVANNO et al., 2005). Os gráficos para demonstração da estrutura foram gerados com o programa Structure (PRITCHARD et al., 2000). A probabilidade de alocação dos indivíduos de golfinhos-rotadores foi testada com o programa Structure. Após a obtenção do melhor K, considerando os dados de genótipos, foi realizada a designação dos indivíduos de golfinhos rotadores em um ou mais clusters 31 inferidos pelos valores de suas probabilidades de correlação ou certificação, ou seja, probabilidades de um dado genótipo (X) pertencer a uma dada população baseado na inferência bayesiana (K) (PRITCHARD et al., 2000). Aqueles que apresentaram probabilidade de correlação acima de 0,6 foram alocados em seu devido cluster, e os que apresentaram probabilidade de correlação abaixo de 0,6 foram excluídos das análises posteriores. Após a alocação dos indivíduos em cada cluster, foi realizada a análise de variância molecular (AMOVA) a fim de testar esta provável estruturação populacional utilizando-se o programa Arlequin v.3.11 (EXCOFFIER et al., 2005). Também foram calculados os índices de diferenciação genética global entre as unidades de população (FST) (WEIR; COCKERHAM, 1984), e índices de RST (estruturação da população), testados com 100.000 interações de Cadeias de Markov e 10.000 permutações por meio dos programas Genepop on the Web (http://wbiomed.curtin.edu.au/genepop) e Fstat v.2.9.3.2 (GOUDET, 2001). Valores de P foram considerados significativos no nível de 0,01 (P≤0,01) e 0,05 (P≤0,05). Valores de RST significativamente maiores do que valores de FST indicam que mutações juntamente com fluxo gênico contribuem para diferenças em frequências entre amostras o que pode ser um sinal filogeográfico (HARDY et al., 2003). Para visualizar relações entre os indivíduos amostrados com base na variação genética, uma Análise de Coordenadas Principais foi realizada utilizando os locais de coleta de acordo com o estabelecido pelo programa GenAlex v. 6.3 (PEAKALL e SMOUSE, 2006). 32 4. RESULTADOS 4.1 Amplificação e polimorfismo dos microssatélites Dos 10 locos avaliados, o marcador SL8 mostrou-se monomórfico na identificação dos alelos, e por isso foi removido das análises posteriores. No teste de desequilíbrio de ligação verificou-se que dos nove marcadores avaliados, dois (SL10 e SLI25) apresentaram-se ligados a outro marcador, não sendo, portanto, utilizados nas análises posteriores. Após a correção de Bonferroni, nenhum dos locos microssatélites avaliados apresentou evidência de abandono de alelos, erros devido à presença de picos stutter e presença de alelos nulos (P≤0,05). Desta forma, dos 10 locos testados sete foram incluídos nas análises populacionais. 4.2 Amostragem Baseado nos sete locos microssatélites, a probabilidade média de não-exclusão para identidade dos indivíduos foi de 1,28x 10-9. Os indivíduos que apresentaram 100% de alelos combinados foram considerados portadores do mesmo genótipo para todos os locos. A identificação dos indivíduos re-amostrados revelou a presença de 20 indivíduos idênticos, portadores do mesmo genótipo, todos estes amostrados pelo método de raspagem de pele no Arquipélago de Fernando de Noronha. Destes vinte, apenas uma cópia do genótipo, ou seja, dez indivíduos foram mantidos para as análises posteriores. Após a remoção dos espécimes replicados o banco de dados consistiu em 404 indivíduos no total, de 414 anteriormente citados. Na genotipagem dos indivíduos, verificou-se que muitos indivíduos apresentavam mais de um loco não amplificado, mesmo após repetições de PCR. Com a remoção destes indivíduos com excesso de “missing data”, totalizou-se 223 indivíduos. As amostras foram provenientes de nove localidades da costa brasileira: quatro amostras do Ceará (CE), duas de músculo e duas de coração; uma amostra do Rio Grande do Norte (RN), sem identificação do tipo de tecido coletado; duas amostras de fígado provenientes de Pernambuco; 177 amostras do Arquipélago de Fernando de Noronha (FN), 163 de pele, seis de fígado, cinco de músculo e três sem identificação do tipo de tecido coletado; três amostras do Espírito Santo (ES), de fígado; 25 amostras de pele provenientes do Rio de Janeiro (RJ); uma amostra de São Paulo (SP), de pele; cinco amostras de pele proveniente de Santa Catarina (SC); e cinco amostras do Paraná (PR), de pele. 33 4.3 Diversidade genética As análises de diversidade foram calculadas, por loco, para a unidade de população formada por todos os indivíduos genotipados. Todos os locos microssatélites apresentaram alto polimorfismo (Tab. 3). A heterozigosidade observada (Ho) variou de 0.9078 (SLO15) a 1.0 (SL01), enquanto a heterozigosidade esperada (He) variou de 0.7064 (SLO15) a 0.9021 (EV94). O Conteúdo de Informações Polimórficas (PIC) oscilou entre 0.656 (SLO15) e 0.892 (EV94) com um valor médio de 0,7867. Dos sete locos microssatélites analisados, a maioria apresentou alto polimorfismo (PIC>0,7), apenas dois com PIC inferior 0.7. De acordo com a classificação de Botstein et al. (1980), marcadores com PIC superior 0.5 são considerados muito informativos. O maior valor de PIC (0.892) corresponde ao microssatélite EV94 que apresentou maior número de alelos (20) (Tab. 3). Foi verificado que não houve valor significativo de coeficiente de endogamia para a população total (FIS total= -0.197) (Tab. 3). Tabela 3. Diversidade genética de golfinhos-rotadores do litoral brasileiro para sete locos microssatélites. (k: número total de alelos; Ho: heterosigosidade observada; He: heterosigosidade esperada; PIC: conteúdo de informação polimórfica; Ra: riqueza alélica; Dg: diversidade genética; FIS: coeficiente de endocruzamento; F(Null): estimativa de frequência de alelos nulos). Locus SD8 SLO15 SL9 SL01 415416 EV1 EV94 k 13 13 11 10 11 18 20 Ho 0.98157 0.90783 0.97235 1.00000 0.99539 0.98182 0.96774 He 0.83902 0.70640 0.83641 0.74057 0.84039 0.82613 0.90209 PIC 0.818 0.656 0.814 0.699 0.820 0.808 0.892 Ra 13.000 13.000 11.000 9.999 11.000 17.973 20.000 Dg (D.P) 0.839 0.706 0.836 0.740 0.840 0.826 0.902 FIS -0.170 -0.286 -0.163 -0.351 -0.185 -0.189 -0.073 Média/Total 13.7 0.97238 0.81300 0.7867 13.710 0.812 -0.197 F(Null) -0.0857 -0.1399 -0.0822 -0.1658 -0.0910 -0.1035 -0.0385 O número de alelos variou de dez para o loco SL01 a vinte para o loco EV94 (Tab. 3, Anexo 3). O loco EV94 apresentou maior riqueza alélica (Ra=20), seguido do EV1 (Ra=17. 973). A média de alelos por loco foi de 13.7; o número efetivo de alelos foi de 5.8 e o número de alelos privados, 13.7. 34 Nas análises de desvio do EHW a localidade melhor amostrada, Arquipélago de Fernando de Noronha (FN), desviou significativamente em todos os locos. A localidade do Rio de Janeiro apresentou desvios do EHW em um loco apenas, EV1 (P<0,05) (Tab. 4). Nas análises de diversidade intrapopulacional os índices de diversidade calculados para as localidades de coleta podem ser visualizados na tabela 5. A população FN (N=177) apresentou o maior valor de número médio de alelos (Nam=12.714) e as populações menos amostradas, RN (N=1) e SP (N=1), apresentaram os menores valores (Nam= 2.0). Para a riqueza alélica, as localidades mais amostradas, FN (N=177) e RJ (N=25), apresentaram os maiores valores de riqueza alélica (Ra= 12.824; Ra=9.017), respectivamente. A localidade do Paraná apresentou o terceiro maior valor de riqueza alélica (Ra= 5.5), mesmo sendo representada por apenas cinco amostras. A maioria das localidades amostradas não apresentou alelos privados, com exceção de três localidades que apresentaram baixas taxas de alelos privados: FN (Nap=2.714), RJ (Nap=0.143) e PE (Nap=0.143). Os índices de diversidade genética total, heterozigosidade observada e heterozigosidade esperada foram altos para todas as localidades amostradas, sendo que a localidade PE foi a que apresentou o maior valor de diversidade genética (Dg=0.881). Para os valores de heterozigosidade observada, com exceção das localidades com apenas um indivíduo amostrado, a localidade PE apresentou o maior valor (Ho=1.00) seguida da localidade FN (Ho=0.9804). Para heterozigosidade esperada a localidade PE foi a que apresentou o maior valor (He= 0.881) seguida da localidade ES (He=0.867). Nenhuma das localidades amostradas apresentou valores significativos de coeficiente de endocruzamento que variou de -0.32743 para a localidade CE a 0.0 para as localidades RN e SP (devido à baixa amostragem) (Tab. 5). 35 Tabela 4. Teste do desvio das frequências alélicas do esperado em EHW, e número de indivíduos (n) por localidade. Loco SD8 SLO15 SL9 SL01 415416 EV1 EV94 CE RN PE (N=4) (N=1) (N=1) 0.65435 0.39999 0.76979 1.00000 1.00000 1.00000 0.31000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.0000 0 1.00000 1.00000 P-valor EHW por população FN ES RJ (N=177) * 0.00000 0.00000* 0.00000* 0.00000* 0.00000* 0.00000* 0.00000* P-valor SP SC PR EHW (N=3) (N=25) (N=1) (N=5) (N=5) Total 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 0.59564 1.00000 0.62145 0.05240 0.83153 0.15092 0.70707 0.00846* 0.74927 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 0.20070 0.89551 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 0.23426 0.61189 0.33897 1.00000 1.00000 1.00000 0.00000 (n=223) 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 (*) Valores significativos de P (P<0,05) para EHW. Tabela 5. Diversidade genética de golfinhos-rotadores do litoral brasileiro amostrados em cada localidade para sete locos microssatélites (N: número de indivíduos; Na: número médio de alelos; Nap: número de alelos privados; Ra: riqueza alélica; Ho: heterosigosidade observada; He: heterosigosidade esperada; Dg: diversidade genética; FIS: coeficiente de endocruzamento). Locus CE RN PE FN ES RJ SP SC PR N Na Nap(D.P) Ra Ho (D.P) He (D.P) Dg (D.P) FIS (P<0,5) 04 01 4.143 (1.345) 2.000 (0.000) 0.0 (0.0) 0.0 (0.0) 3.643 - 0.96429 (+/-0.09449) 0.842857 (+/- 0.527430) 0.857143 (+/- 0.872872) -0.32743 (0.994135) 0.00000 (1.000000) 02 3.286 (0.488) 0.143 (0.143) 3.285 1.00000 (+/-0.00000) 1.00000 (+/-0.00000) 0.79252 (+/-0.10406) 1.00000 (+/-0.00000) 0.88095 (+/- 0.08133) 0.880952 (+/- 0.617956) -0.21739 (1.000000) 177 12.714(3.904) 0.98036 (+/-0.02268) 0.80488 (+/-0.06445) 0.785597(+/- 0.418900) -0.23367 (1.000000) 03 4.000 (0.816) 2.714 (0.944) 0.0 (0.0) 12.824 3.257 0.95238 (+/- 0.12599) 0.86667 (+/-0.09428) 0.844444 (+/- 0.543033) -0.20635 (0.869990) 25 9.143(2.968) 0.143 (0.143) 9.017 0.94400 (+/- 0.06974) 0.81513 (+/-0.08133) 0.781633 (+/- 0.525866) -0.27174 (1.000000) 01 2.000 (0.000) 0.0 (0.0) - 1.00000 (+/- 0.00000) 1.00000 (+/-0.00000) 0.857143 (+/- 0.872872) 0.00000 (1.000000) 05 5.429 (1.718) 0.0 (0.0) 4.978 0.97143 (+/- 0.07559) 0.84887 (+/-0.08926) 0.829630 (+/- 0.494433) -0.21101 (0.996090) 05 5.571 (0.976) 0.0 (0.0) 5.571 0.88571 (+/-0.22678) 0.82540 (+/-0.09807) 0.825397 (+/- 0.483999) -0.08297 (0.911046) D.P. Desvio Padrão. (-) Valores não calculados. 36 4.4 Estruturação genética populacional O programa Structure inferiu que o melhor K foi aquele que apresentou o maior valor para o ΔK (Fig. 7). A estatística DeltaK identificou claramente que a média mais alta de probabilidade posterior ocorreu em K=2, assim foi possível visualizar a distribuição da variabilidade genética dos indivíduos conforme essa estrutura (Fig. 8), sendo portanto consideradas duas unidades populacionais. Na figura 8, as barras verticais correspondem a cada localidade do litoral brasileiro amostrada e as diferentes espessuras representam a amostragem de cada uma, enquanto as duas cores referem-se aos dois clusters estimados pelo DeltaK, representados graficamente pelo Structure. Quando existe uma linha vertical de uma única cor significa que 100% do genoma dos indivíduos analisados pertencem a este cluster. Figura 7. Estimativa do melhor K pela estatística DeltaK inferida com o programa Structure. 37 Figura 8. Número de clusters encontrados para golfinhos-rotadores do litoral brasileiro. Distribuição da estrutura genética dos genótipos dos indivíduos avaliados neste estudo com o programa Structure para K=2. Os números indicam os locais de coleta: 1- Santa Catarina; 2- Paraná; 3- Rio de Janeiro; 4- Espírito Santo; 5 Pernambuco; 6 Rio Grande do Norte; 7- Arquipélago de Fernando de Noronha; 8- São Paulo; 9- Ceará. A partir disso, alocaram-se os indivíduos nos dois clusters indicados pelo programa Structure. Identificou-se que a proporção geral de adesão de cada indivíduo em cada cluster foi de aproximadamente 50% (0.464 para o cluster 1 e 0.536 para o cluster 2). Apenas os indivíduos que apresentaram probabilidade de adesão a um dos clusters acima de 60% foram alocados em seu devido grupo. Os indivíduos que apresentaram probabilidade de adesão abaixo deste valor foram excluídos das análises posteriores. Deste modo, 17 indivíduos foram excluídos, 16 da localidade do Arquipélago de Fernando de Noronha (FN) e um da localidade de São Paulo (SP). Sendo assim, noventa e três indivíduos foram alocados no cluster 1: 51 (FN), 25 (RJ), três (ES), um (RN), um (CE), dois (PE), cinco (SC) e cinco (PR); e 113 indivíduos no cluster 2: 110(FN) e três (CE). Para as análises posteriores o cluster 1 foi denominado Unidade de População 1 (UP1) e o cluster 2 Unidade de População 2 (UP2). A Análise de Variância Molecular (AMOVA) utilizada para testar a estruturação entre essas duas unidades de população revelou FST de 2.16%, altamente significativo (Tab. 6). Os índices de FST e RST entre estas duas unidades de população mostraram níveis de diferenciação significativos: FST: 0.0228; RST: 0.0187 (P≤0,001). A AMOVA entre as duas diferentes unidades de população contendo somente os indivíduos de FN (UP1: 51 (FN) e UP2: 110 (FN)) revelou FST de 1.86% (P≤0,05), altamente significativo. Os índices de FST e RST também mostraram níveis de diferenciação significativos: FST: 0.0206; RST: 0.0111 (P≤0,001). 38 Tabela 6. Análise de Variância Molecular (AMOVA) para as duas unidades de população indicadas pelo programa Structure. Graus de Soma dos Componentes de Percentual de Liberdade Quadrados Variação Variação Entre populações 1 14.878 0.05968 Va 2.16 Dentro de populações 410 1106.433 2.69862 Vb 97.84 Total 411 1121.311 2.75830 FST 0.02164 P-value > 0.000001 Fonte de Variação P≤0,05. A Análise de Coordenadas Principais (PCoA) baseada nas distâncias genéticas dos genótipos dos indivíduos foi realizada de acordo com os locais de coleta. Esta análise demonstrou, principalmente, que os indivíduos amostrados no Arquipélago de Fernando de Noronha não estão separados dos demais, e que os indivíduos do Rio de Janeiro se encontram quase que totalmente em um componente principal (Fig. 10). Figura 9. Análise de Coordenadas Principais (PCoA) realizada a partir de uma tabela de frequências alélicas baseada em sete locos microssatélites de golfinhos-rotadores do litoral brasileiro. 39 Nesta análise foram apresentados três componentes responsáveis pela variação entre os indivíduos de golfinho-rotador. O primeiro componente principal foi responsável por 20.91% do total da variação observada, enquanto que o segundo componente explicou 18.58% da variação e o terceiro 17.91%. Os três componentes resultaram em um percentual cumulativo de 56.4%. A análise de cluster bayesiana realizada pelo programa Structure indicou duas unidades de população e demostrou que os indivíduos do Arquipélago de Fernando de Noronha (FN) e Ceará (CE) ficaram alocados nas duas unidades de população e que os indivíduos amostrados no Rio de Janeiro (RJ) ficaram todos alocados em uma mesma unidade de população, assim como os indivíduos das demais localidades amostradas (Fig.8). Estes mesmos resultados também foram indicados pela Análise de Coordenadas Principais (PCoA) (Fig. 9). A AMOVA apresentou valores significativos para a estruturação indicada pelas análises do programa Structure (Tab. 6) e os índices de fixação par-a-par entre estas duas unidades de população também foram significativos. Deste modo, considerou-se que esta seria a estruturação populacional mais provável para os golfinhos-rotadores amostrados até o momento no litoral brasileiro. Foi verificado que a UP2 desviou do EHW em todos os locos confirmando o desvio de EHW em uma análise loco-por-loco. UP1 desviou do EHW em quatro locos, SD8, SL01, 415/416 e EV1. De acordo com o modelo mutacional SMM, o teste de Wilcoxon revelou padrões não significativos de excesso de heterozigosidade para a UP1 (P=0.9727) e significativos para a UP2 (P=0.4063) (P>0,05). Já para o modelo mutacional TPM, o teste de Wilcoxon revelou padrões significativos de excesso de heterozigosidade para a UP1 (P= 0.4063) e para a UP2 (P=0.0039) (P>0,05). Estes resultados demonstram que as duas unidades de população possivelmente passaram por algum evento de gargalo populacional. Quanto à deficiência de heterozigotos, sob o modelo mutacional SMM, o teste de Wilcoxon revelou padrões significativos para UP1 (P=0.0391) (P>0,05) e padrões não significativos para UP2 (P=0.6563). Já sob o modelo mutacional TPM o teste de Wilcoxon revelou padrões não significativos de deficiência de heterozigotos tanto para UP1 (P=0.6563) quanto para UP2 (P=1.0). As medidas de diversidade genética podem ser visualizadas na tabela 7. UP1 apresentou a maior diversidade genética (Dg=0.7902), maior número médio de alelos (Nam=13.143) e maior riqueza alélica (Ra=13.1). Quanto ao número de alelos privados, UP2 apresentou um valor muito baixo (Nap=0.571) comparado a UP1 (Nap=0.571). Quanto ao 40 número de alelos privados, UP2 apresentou um valor muito baixo (Nap=0.571) comparado a UP1 (Nap=5.0). Os índices de heterozigosidade foram altos para as duas unidades populacionais, UP2 apresentou o maior valor de heterozigosidade observada (Ho=0.9833), comparado a UP1 (Ho=0.9615) e UP1 o maior valor de heterozigosidade esperada (He=0.8211), comparado a UP2 (He=0.79349). Quanto ao coeficiente de endogamia, as duas unidades populacionais apresentaram valores negativos e não significativos: UP1(FIS= -0.2192) e UP2 (FIS=-0.2517). Tabela 7. Diversidade genética de golfinhos-rotadores das duas unidades de população do litoral brasileiro para sete locos microssatélites (N: número de indivíduos; Na: número médio de alelos; Nap: número de alelos privados; Ra: riqueza alélica; Ho: heterosigosidade observada; He: heterosigosidade esperada; Dg: diversidade genética; FIS: coeficiente de endocruzamento). Locus N Na Nap Ra UP1 93 13.143 5.0 13.1 UP2 113 8.714 0.571 8.5 P≤0,05. Ho (D.P) He (D.P) Dg (D.P) FIS 0.96145 0.82109 0.790235 -0.21917 (+/-0.03894) (+/-0.07038) (+/-0.522758) (+/-1.00000) 0.98333 0.79339 0.779570 -0.25172 (+/-0.02465) (+/-0.06336) (+/-0.416655) (+/-1.00000) 41 5. DISCUSSÃO 5.1 Diversidade genética Os resultados revelaram alta diversidade genética, alta heterozigosidade observada e esperada para os indivíduos de Stenella longirostris amostrados em diferentes localidades do litoral brasileiro (Tab. 5) e para as duas unidades de população indicadas nas análises de estruturação genética populacional (Tab. 7). Valores altamente significativos de diversidade genética tanto a nível mitocondrial quanto a nível nuclear já foram reportados para várias espécies de golfinhos (OREMUS, 2008; ANDREWS et al., 2010; CABALLERO et al., 2011; COSTA-URRATIA et al., 2011; AMARAL et al., 2012). Golfinhos-rotadores das ilhas do Havaí apresentaram valores altamente significativos de diversidades haplotípicas e nucleotídicas e riqueza alélica, entretanto, os padrões diversidade genética foram mais evidentes para análises com DNA mitocondrial do que para as análises com microssatélites (ANDREWS et al., 2010). Sequências de DNA mitocondrial de indivíduos de S. longirostris do litoral do Brasil relataram baixa diversidade haplotípica e nucleotídica (VOLPI, 2012). Esta pesquisa revelou a presença de quatro grupos genéticos para o litoral brasileiro com diferenciação genética significativa entre si: G1, grupo composto pelos indivíduos do Nordeste brasileiro; G2, grupo formado por 38 indivíduos do Arquipélago de Fernando de Noronha; G3, grupo composto por dois indivíduos desta localidade; e, G4, grupo formado pelos indivíduos do Sul e sudeste brasileiro. Sequências concatenadas de D-loop e COI (DLP+COI) revelaram os maiores valores de diversidade nucleotídica para G1 (π: 0.010) e G4 (π: 0.010), e o menor valor para G2 (π: 0.001), G1 (h=1.0) e G4 (h=0.96) apresentaram os valores mais altos de diversidade haplotípica, e G2 apresentou (h=0.38) o valor mais baixo (VOLPI, 2012). Uma análise populacional de golfinhos-rotadores amostrados no Arquipélago de Fernando de Noronha demonstrou baixa diversidade haplotípica (h: 0.4346) e nucleotídica (π: 0.006556) para a região controle do DNA mitocondrial (D-loop) (FARIA, 2010) e baixa heterozigosidade observada (Ho: 0.19) para genótipos de microssatélites (FARRO, 2006). Estes índices foram os menores reportados dentre a maioria das espécies de cetáceos e dentre golfinhos-rotadores de outras localidades do mundo, com exceção dos golfinhos de Hector (Cephalorhinchus hectori) do norte da Islândia (h: 0.410) (PICHLER e BAKER, 2000). 42 A alta diversidade genética encontrada neste estudo e a riqueza alélica relatada aqui e por Farro (2006), bem como a baixa diversidade haplotípica demonstrada por Faria (2010) e Volpi (2012) nos fornecem indícios de que os golfinhos-rotadores do Arquipélago de Fernando de Noronha apresentam fluxo gênico resultante de visitas temporárias, possivelmente de machos, e imigração tanto de fêmeas quanto de machos talvez viajando em grupos, como já reportado para a espécie nas ilhas da Polinésia Francesa (OREMUS et al., 2007). 5.2 Desvios do EHW O principio de Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) é até hoje considerado a base da genética de populações. De acordo com este princípio uma população de tamanho ideal, com cruzamentos aleatórios, não sofre pressão seletiva e consequentemente não apresenta alterações nas frequências alélicas entre as gerações (FRANKHAM, 1997). Desvios do EHW podem ser resultantes de deriva genética, seleção, mutação, efeito fundador e efeito gargalo, de endogamia, de má amostragem e/ou genotipagem, ou ainda do efeito Whalund (quando há diferenciação genética entre populações que tenham sido analisadas como uma única) (FRANKHAM, 1997). Quando fatores evolutivos causam desequilíbrio nas frequências gênicas e genotípicas, apenas uma geração de acasalamento ao acaso, sem a ocorrência de tais fatores, pode restabelecer o equilíbrio (FRANKHAM, 1997). Considerando todos os indivíduos avaliados no litoral brasileiro, os golfinhosrotadores amostrados no Arquipélago de Fernando de Noronha apresentaram desvios EHW em todos os locos analisados. Os amostrados no litoral do Rio de Janeiro desviaram do EHW no loco EV1 (Tab. 4). Já para a estruturação populacional mais provável em duas unidades de população, UP2 desviou do EHW em todos os locos analisados e a UP1 desviou do EWH em quatro locos. CALLEN et al. (1993) afirmaram que se a proporção de genótipos de um loco não está em EHW para algumas populações, pode-se suspeitar da ocorrência de uma seleção afetando tal loco ou ainda a existência de alelos nulos. Este é um problema comum nos estudos com microssatélites explicado pela baixa eficiência da hibridização dos primes usados para amplificar um determinado loco. No entanto, para os golfinhos-rotadores do litoral brasileiro verificou-se a ausência de alelos nulos e não-ocorrência de endocruzamento (Tabs. 3, 5 e 7). Uma das explicações prováveis para os desvios do EHW detectados pelas duas unidades de população pode ser o efeito gargalo, uma vez que os resultados do Teste de 43 Wilcoxon demonstraram que as duas unidades de população (UP1 e UP2) apresentaram valores significativos de excesso de heterozigotos sob o modelo mutacional TPM. Populações que passaram por reduções recentes no seu tamanho populacional efetivo exibem redução no número de alelos e na diversidade genética em locos polimórficos. No entanto, o número de alelos sofre redução mais rápida do que a diversidade genética. Deste modo, em uma população que sofreu recente gargalo populacional, a diversidade genética observada é maior do que a diversidade genética esperada em equilíbrio, que é computada a partir do número de alelos observado, sob a suposição de uma população de tamanho constante (equilíbrio) (LUIKART et al., 1998). O teste de Wilcoxon sob o modelo mutacional SMM também demonstrou deficiência de heterozigotos para UP1. Entretanto, um dos problemas deste modelo mutacional recai em separar o sinal genético de uma população que passou por efeito gargalo de um rápido crescimento populacional subsequente, já que o último sinal pode obliterar o primeiro (BONHOMME et al., 2008). Deficiência de heterozigotos pode indicar um aumento populacional recente ou influxo de alelos raros de imigrantes, entretanto, os locos podem raramente estar em deriva mutacional devido a flutuações naturais no tamanho populacional ou seleção natural (LUIKART et al., 1998). Durante uma rápida expansão populacional, novos alelos são introduzidos na população rapidamente via mutação, entretanto, esses novos alelos estão em baixa frequência criando um excesso de diversidade alélica que poderia ser previsto para uma população sem crescimento em equilíbrio de deriva mutacional (MARUYAMA e FUERST, 1984). Assim, uma redução transitória na heterozigosidade (ou concomitantemente, um passageiro aumento de homozigotos) é previsto como rápido crescimento populacional (MARUYAMA e FUERST, 1984). Possíveis subdivisões dentro de populações (efeito Whalund) também podem ser uma explicação para a deficiência de heterozigotos da UP1, devido à mistura de indivíduos residentes e transientes do Arquipélago de Fernando de Noronha (SILVA-JR, 1996; SILVA e SILVA-JR, 2009). O efeito Whalund explica desvios do EWH em populações fragmentadas que são tratadas como uma única unidade (HARLT e CARL, 1997) e já foi reportado para populações de golfinhos-nariz de garrafa no Mar do Caribe (CABALLERO et al., 2011). Efeitos das flutuações ao acaso nas frequências alélicas ou da deriva genética tendem a serem maiores em populações insulares e podem estar atuando nas unidades de população analisadas afetando o EHW (FRANKHAM, 1997). Além disso, a imigração ou o fluxo de genes de alelos raros de uma fonte externa podem afetar o EHW, o que poderia ser a resposta 44 com a sugestão de que existam, além dos indivíduos residentes no Arquipélago de Fernando de Noronha, os indivíduos transientes (SILVA-JR, 1996; SILVA e SILVA-JR, 2009). 5.3 Estruturação genética populacional Os resultados da análise de cluster bayesiana (Structure v. 2.3.3), análise de Coordenadas Principais (PCoA), AMOVA e diferenciação genética demonstraram estruturação populacional mais provável em duas unidades populacionais para os golfinhosrotadores do litoral brasileiro (Figs 8 e 9, Tab. 6). Valores de FST e RST são similares aos encontrados em outros estudos com golfinhos que concluíram diferenciação populacional (ESCORZA-TREVIÑO et al., 2005; NATOLI et al., 2005; PARSONS et al., 2006; OREMUS et al., 2007; ANDREWS et al., 2010; COURBIS, 2011). A estruturação populacional obtida neste estudo a partir de uma análise com microssatélites é diferente da obtida com duas regiões do DNA mitocondrial (D-loop e COI) (VOLPI, 2012) para a mesma espécie e as mesmas localidades. Volpi (2012) indicou estruturação genética em quatro grupos: G1, composta por indivíduos amostrados no Ceará, Rio Grande do Norte e Pernambuco: G2, População 1 do Arquipélago de Fernando de Noronha; G3, População 2 do Arquipélago de Fernando de Noronha; e G4, composta por indivíduos amostrados no Sudeste e Sul do Brasil. Resultados de análises de microssatélites podem estar refletindo níveis de fluxo gênico mediados por fêmeas e machos, diferente de fluxo gênico histórico evidenciado em análises de DNA mitocondrial. Adicionalmente, essas diferenças podem ser o resultado da inclusão de um maior número amostral. Verificou-se que a separação das duas unidades de população não demonstrou relação com seus respectivos locais de coleta, indicativo de existência de fluxo gênico mesmo entre regiões distantes. Indivíduos amostrados no Arquipélago de Fernando de Noronha e no Ceará estão representados nas duas unidades de população. De fato, em espécies altamente móveis, que apresentam baixo custo energético para locomoção e de distribuição contínua (MARTIN et al., 1990; WURSIG et al.,1994 b; WELLS e GANNON, 2005) pouco se sabe sobre as barreiras que podem atrapalhar o movimento destas e por isso é difícil delimitar quantidades de unidades de população existentes (ROSEL et al., 1999). Desta forma, a atribuição de indivíduos a uma população baseada somente na origem da amostragem pode não ter significado biológico (PRITCHARD et al., 2000). Adicionalmente, as amostras de várias localidades são provenientes de animais encalhados e, assim, a origem delas não é inteiramente clara. 45 Os resultados de diferenciação genética entre as duas unidades de população encontradas para o Arquipélago de Fernando de Noronha com DNA mitocondrial (FARIA, 2010; VOLPI, 2012) foram corroborados com análises de microssatélites desta pesquisa. A AMOVA entre as duas unidades de população contendo somente os indivíduos de FN (UP1: 51 (FN) e UP2: 110 (FN)) mostrou-se altamente significativa (AMOVA: FST: 1.86%; P≤0,05), assim como os índices de diferenciação genética (FST: 0.0206; RST: 0.0111; P≤0,001). Estes resultados demonstram que o Arquipélago de Fernando de Noronha pode estar recebendo indivíduos de várias localidades do Brasil, uma vez que os indivíduos amostrados in vivo neste arquipélago estão presentes nas duas unidades de população. No entanto, valores de diferenciação genética significativos, porém, baixos, sugerem ocorrência de fluxo gênico entre as unidades de população. O fluxo gênico entre populações de golfinhos não-insulares pode ser mais frequente do que em populações insulares, uma vez que ilhas apresentam recursos e muitas áreas de descanso (ANDREWS et al., 2010), assim como as ilhas do Arquipélago de Fernando de Noronha. Além disso, estrutura de metapopulação com comunidades insulares evolutivamente conectadas por meio de fluxo gênico de machos e fêmeas pode ser a explicação para populações relativamente isoladas por distância (OREMUS et al., 2007). Golfinhos-rotadores de Noronha vivem na Cadeia de Montanhas Submarina de Fernando de Noronha, entretanto, há registros de golfinhos que foram marcados no arquipélago no Estado da Paraíba e no Arquipélago de São Pedro e São Paulo, os quais podem ter se afastado desta cadeia de montanhas em busca de novos recursos alimentares, para evitar predadores ou minimizar concorrência com outros golfinhos (SILVA-JR, 2010). Estas observações reforçam a ideia de que existem golfinhos-rotadores residentes neste arquipélago e que este recebe indivíduos de outras localidades diariamente, o que pode ser a explicação para o resultado de estruturação genética em duas unidades de população geneticamente distintas para este arquipélago com valores significativos, porém baixos. Outra possível explicação para os valores baixos de diferenciação genética entre as duas unidades de população pode ser o reflexo da grande capacidade de deslocamento destes golfinhos, que podem percorrer de 300 a 700 km (MARTIN et al., 1990; WURSIG et al.,1994 b). Além disso, essa espécie geralmente apresenta um modelo de organização social de “fissão-fusão” com a formação diária de grupos com mais de 1000 indivíduos (NORRIS et al., 1994), o que já foi documentado para o Arquipélago de Fernando de Noronha no litoral brasileiro, onde são observados grandes grupos de golfinhos–rotadores com uma média de 600 indivíduos por dia (SILVA JR, 2005; SILVA; SILVA JR, 2009). Este fato pode favorecer 46 a troca de genes entre indivíduos que se deslocam pelo litoral brasileiro e se encontram nas ilhas e atóis para descansar, procurar alimento e reproduzir. Diferenças em preferências de hábitat, tipo e abundância de presas entre áreas adjacentes do oceano têm sido sugeridos como as razões para diferenciação genética em unidades de população de golfinhos (GARCÍA-MARTÍNEZ et al., 1999; MÖLLER et al., 2007; BILGMANN et al., 2008; WISZNIEWSKI et al., 2010). Andrews et al. (2010) sugeriram que diferenças de habitat podem aumentar barreiras ecológicas ao fluxo gênico que impulsionam a diferenciação em unidades de população de golfinhos-rotadores próximas a Ilhas Havaianas e que a disponibilidade de recursos também é um fator de grande influência na distribuição do golfinho-rotador, visto que pode influenciar os padrões de dispersão e estrutura social nas unidades de população de águas adjacentes (ANDREWS et al., 2010). Este fator pode explicar a diferenciação genética dos indivíduos de golfinhos-rotadores amostrados no Arquipélago de Fernando de Noronha que foram alocados nas duas diferentes unidades de população, possivelmente uma residente, que permanece neste arquipélago devido à grande quantidade de recursos e áreas de descanso e a outra formada por indivíduos transientes que se deslocam para outras áreas do oceano à procura de outros recursos alimentares. Consequências de alterações climáticas também têm sido apontadas como as causas de mudanças de habitat e alterações no fluxo gênico de pequenas unidades de população de cetáceos (FONTAINE et al., 2007; TAGUCHI et al., 2010). As correntes marítimas superficiais do Brasil exercem papel altamente significativo na distribuição dos golfinhos-rotadores e podem exercer papel importante nos níveis de fluxo gênico entre unidades de população do litoral brasileiro. A Corrente do Brasil (C28) e a Corrente das Malvinas (C43) são consideradas como o limite de distribuição desta espécie ao sul do Brasil e favorecem o deslocamento destes golfinhos para o sul do país nas estações quentes, nas estações mais frias estes golfinhos se movem para o norte do país (SECCHI; SICILIANO, 1995; MORENO et al., 2005) (Fig. 10). As adjacências de Pernambuco, onde a Corrente Sul- Equatorial (C27) bifurca para o norte (Corrente Norte do Brasil, C8) e sul (Corrente do Brasil, C28), podem ser o limite de distribuição de S. longirostris entre Nordeste e Sudeste/Sul do Brasil. A Corrente Sul- Equatorial (C27) pode favorecer o deslocamento dos golfinhos-rotadores do Arquipélago de Fernando de Noronha em direção a costa brasileira (Fig. 10). 47 Figura 10. Maiores correntes superficiais oceânicas (C.) (Okolodkov, 2010). Legenda: 1. Deriva Transártica (Transpolar), 2. Giro de Beaufort, 3. C. de Labrador, 4. C. da Groenlândia Ocidental, 5. C. da Groenlândia Oriental, 6. C. de Irminger, 7. C. da Islândia Oriental, 8. C. Norte do Brasil, 9. C. da Guiana, 10. C. do Caribe, 11. C. de Iucatã, 12. C. de Laço, 13. C. da Flórida, 14. C. das Antilhas, 15. C. do Golfo, 16. C. do Atlântico Norte, 17. C. da Deriva do Atlântico Norte, 18. C. da Noruega, 19. C. do Cabo Norte, 20. C. dos Açores, 21. C. das Canarias, 22. C. Norte Equatorial, 23. Contracorrente Equatorial, 24. C. de Guiné, 25. C. de Angola, 26. C. de Benguela, 27. C. Sul Equatorial, 28. C. do Brasil, 29. C. do Atlântico Sul, 30. C. de Agulhas, 31. C. da Somália, 32. C. de Austrália Ocidental, 33. C. de Índico Sul, 34. C. da Austrália Oriental, 35. C. de Kuroshio, 36. C. de Oyashio, 37. C. do Pacífico Norte, 38. C. Subártica, 39. C. do Alasca, 40. C. da Califórnia, 41. C. do Peru, 42. C. do Cabo de Hornos, 43. C. das Malvinas, 44. C. do Pacífico Sul, 45. C. Antártica Circumpolar, 46. Deriva dos Ventos do Oeste. 48 6. CONCLUSÕES Os resultados obtidos demonstraram que os golfinhos-rotadores do litoral brasileiro apresentam diversidade genética, heterozigosidade observada e esperada, e riqueza alélica altas. A estruturação mais provável identificou a presença de duas unidades de população com diferenciação genética significativa entre si. Esta estruturação agrupou indivíduos amostrados em diferentes áreas do litoral brasileiro sugerindo que existe fluxo gênico mesmo entre regiões distantes. 49 7. REFERÊNCIAS AMOS, B; SCHLOTTERER, C; TAUTZ, D. Social structure of pilot whales revealed by analytical DNA profiling.Science, v. 30, p. 670–672, 1993. AMOS, W. et al. Automated binning of microsatellite alleles: problems and solutions. Molecular Ecology, Notes 7, p.10–14, 2006. ANDREWS, K. R. et al. Patterns of genetic diversity of the Hawaiian spinner dolphin (Stenellalongirostris).Atoll Research Bulletin, v. 543, p. 65-73. 2006. ANDREWS, K. R. et al. 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Molecular Ecology, v. 11, p. 1-16, 2002. 63 ANEXOS 64 ANEXO 1 Protocolo de extração com a resina Chelex a 5% Soluções: Chelex (Sigma) diluído em ddH2O a uma concentração de 5%. Preparação de Chelex 5%: 2,5 g de Chelex em 50 mL de agua miliQ (estéril). Armazenar na geladeira. Procedimentos: 1. Colocar 200μL de Chelex 5% nos tubos. - Cortar a ponta da ponteira de 1000 microlitros. - Utilizar tesoura esterilizada com hipoclorito e álcool e flambada na chama. - Com esta ponteira, pegar200μL de Chelex 5%, com cuidado para pegar uma boa quantidade de bolinhas da resina. - Colocar esta quantidade em um tubo de 1,5mL devidamente nomeado. 2. Com auxílio de uma pinça e um bisturi, cortar o tecido em cima de um Parafilm, apoiado em uma placa de Petri. - Utilizar placa de Petri esterilizada com hipoclorito e álcool, e pinça e lâmina esterilizadas e flambadas. - Trocar o Parafilm e esterilizar a pinça e a lâmina a cada vez que trocar de tecido. 3. Colocar o pedaço de tecido cortado no tubo de 1,5mL já nomeado e com Chelex 5%, no meio de onde as bolinhas estão concentradas. 4. Colocar os tubos em banho-seco ou banho maria nas seguintes condições - 65oC por 16 horas. - 95 ºC por 15 min 5. Centrifugar os tubos a 14000 rpm por 3minutos. 6. Transferir o sobrenadante para um novo tubo devidamente nomeado com cuidado de não transferir bolinhas da resina. - Utilizar ponteiras de 20 a 200 μL, uma ponteira a cada indivíduo. Se as bolinhas obstruírem a ponteira, dispensar a bolinha e repetir o procedimento. - Posicionar a ponteira no fundo do tubo e puxar a quantidade total de sobrenadante. 7. Pronto, o DNA já está extraído. Deixar na geladeira por 24 hs e depois quantificar as amostras. 65 ANEXO 2 Protocolo de extração com solução salina adaptado por David Vieites - U.C. Berkeley Soluções: Tampão de extração* ddH2O estéril SDS 10% Proteinase K 20mg/Ml NaCl (5M) Isopropanol Etanol 80% Procedimentos: 1. Com auxílio de uma pinça e um bisturi, corte o tecido em cima de um Parafilm apoiado em uma placa de Petri. Use água sanitária e álcool para esterilizar a pinça e o bisturi cada vez que trocar de tecido. Adicione o tecido picado a um tubo de 1,5mL. 2. Adicionar a solução de lise aos tubos (410μL de buffer de extração + 80μL SDS 10% + 15μL proteinase K (20μ/μL). (opcional: + 2μL Rnase A). OBS: Se for deixar os tecidos digerindo overnight, acrescentar apenas 10μL de proteinase K. 3. Incubar a 55ºC por aproximadamente 2 horas (vortexar a cada 10 minutos) até a digestão do tecido. 4. Centrifugar a 13.000 rpm por 5 minutos. - Transferir o sobrenadante (líquido) para um novo tubo de 1,5mL. - Adicionar 180μL NaCl (5M). - Inverter o tubo 50 vezes para homogeneizar. Um precipitado branco será formado. Se a coloração do precipitado não for branca, o reagente NaCl está velho. 5. Centrifugar a 13.000 rpm por 5 minutos. - Transferir o sobrenadante para um novo tubo (manter em um bloco resfriado) e adicionar 1.000μL de isopropanol gelado; - Misturar gentilmente. 6. Centrifugar a 13.000 rpm por 7 minutos. - Descartar sobrenadante. 66 - Adicionar 250μL etanol 80%. - Inverter 50 vezes para misturar. 7. Repetir o passo nº6. 8. Centrifugar a 13.000 rpm por 7 minutos. - Descartar sobrenadante. - Remover álcool completamente no banho a 50-55ºC. 9. Ressuspender o DNA em 50-100μL de água ultrapura ou tampão TE. OBS: Sem pellet colocar 25μL. Com muito pellet colocar até 200μL. 10. Deixar na geladeira overnight (4ºC) para diluir a pellet. * Tampão (Buffer) de Extração (Autoclavar): 1M Tris ( pH= 8) 0.5mL 5MNaCl 1.0mL 0.5M EDTA (pH= 8) 1.0mL ddH2O estéril 47.5mL Observações: Os reagentes e princípios aplicados são os de Brufordet al. (1992). David Vieites adequou algumas quantidades, materiais e procedimentos para facilitar a extração. BRUFORD, M. W.; HANOTTE, O.; BROOKFIELD, J. F. Y.; BURKE, T. Single-locus and multilocus DNA fingerprinting. In: Molecular genetic analyses of populations: A Pratical Approach. HOELZEL, A. R. (Ed.). Oxford: IRL Press, 1992. p. 225-269. 67 ANEXO 3 Figura 1. Frequências alélicas para cada loco microssatélite. 68 Figura 1. Frequências alélicas para cada loco microssatélite.
