ISOLAMENTO EM MEIO SELETIVO LGI-P DE BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS ASSOCIADAS À CULTURA DA MANDIOCA (Manihot esculenta) Maria Camila de Barros Silva1, Fernando José Freire2, Júlia Kuklinsky-Sobral3, Michelangelo de Oliveira Silva4, Marisângela Viana Barbosa5, Diogo Paes da Costa5 & Pedro Avelino Maia de Andrade5 Introdução A mandioca (Manihot esculenta Crantz) é uma planta originária do continente americano, provavelmente do Brasil, sendo a principal fonte de carboidratos para milhões de pessoas, especialmente nos países em desenvolvimento, além de ter grande importância no setor industrial. De acordo com Suzuki [1] a importância da cultura está na produção de raízes tuberosas e feculentas que são utilizadas na alimentação humana e animal, na fabricação de produtos diversos e na produção de álcool. O Brasil é o segundo produtor mundial desta cultura, com cerca de dois milhões de hectares plantados, estimando-se mais de 26 milhões de toneladas colhidas para a safra 2009 [2]. Toda planta é um ambiente propicio a colonização por microrganismos, alguns maléfico e outros benéficos, destes um dos mais estudados são as bactérias promotoras de crescimento vegetal, que associadas às plantas hospedeiras aumentam o vigor da planta e consequentemente o aumentam a produção. Dentre estas, estão algumas bactérias endofíticas promotoras de crescimento vegetal [3]. Além da forte atuação na produção agrícola, as bactérias podem se tornar um grande potencial na indústria alimentícia, cosmética e farmacêutica, já que segundo Menéndez et al. [4] algumas linhagens bacterianas são capazes de produzir levana, um exopolissacarídeo constituído por unidades de frutose, obtidas pela reação de transfrutosilação durante a fermentação de microrganismos em meio rico em sacarose, utilizado na indústria farmacêutica como anticarcinógeno e na indústria cosmética e alimentícia como agente espessante e adoçante. Considerando-se que as plantas são um microecossistema complexo onde diferentes nichos são explorados por uma extensa variedade de bactérias que apresentam relações neutras e simbióticas com a planta hospedeira [5], este trabalho teve como objetivos: isolar em meio LGI-P, caracterizar morfologicamente e selecionar linhagens bacterianas endofíticas produtoras de levana (exopolissacarídeo que apresenta inúmeras aplicações biotecnológicas) associadas a plantas de mandioca cultivadas no Estado de Pernambuco. Material e métodos A. Amostra vegetal Foram utilizadas amostras de caules e raízes de plantas de mandioca cultivadas no município de Garanhuns, PE, (latitude 8051’25’’S e longitude 36027’’31’’O), durante o primeiro semestre de 2009. As amostras vegetais foram coletadas 16 meses após o plantio, sendo identificadas e levadas ao Laboratório de Genética e Biotecnologia Microbiana (LGBM) da Unidade Acadêmica de Garanhuns (UAG/UFRPE) para processamento das análises. B. Isolamento de bactérias endofíticas Após a coleta, as amostras vegetais foram lavadas para retirada de resíduos de poeira e solo. Então foram cortadas em segmentos de 08 a 12cm, sendo lavados em álcool 70%, e, em seguida, retirada toda sua epiderme. Aproximadamente 1g das amostras de raízes e 0,5g das amostras de caules foram cortadas, assepticamente, em pequenos fragmentos e triturados em 4ml de tampão PBS. Após estas etapas, 100µL de cada solução foram inoculados, em triplicatas, em meio semi-sólido LGI-P, seletivo para Gluconacetobacter diazotrophicus, segundo Dobereiner et al. [6], e incubados a 28ºC. As películas formadas foram riscadas em meio LGI-P sólido, acrescido 20mg/L de extrato de levedura, incubadas ________________ 1. Aluna de Graduação em Agronomia da Unidade Acadêmica de Garanhuns, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Av. Bom Pastor, s/n, Boa Vista, Garanhuns, PE, CEP 55296-901. E-mail: [email protected] 2. Professor Adjunto do Departamento de Agronomia, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Rua Dom Manuel de Medeiros, Dois Irmãos, Recife, PE, CEP 52171-900. 3. Professora Adjunta da Unidade Acadêmica de Garanhuns, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Av. Bom Pastor, s/n, Boa Vista, Garanhuns, PE, CEP 55296-901. 4. Doutorando do PPG em Ciência do Solo, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Rua Dom Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos, Recife, PE, CEP 52171-900. E-mail: [email protected] 5. Alunos de Graduação em Agronomia da Unidade Acadêmica de Garanhuns, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Av. Bom Pastor, s/n, Boa Vista, Garanhuns, PE, CEP 55296-901. Apoio financeiro: CNPq e FACEPE. a 28°C por 7-10 dias, em seguida realizou-se a purificação das colônias pela técnica de esgotamento. Colônias puras foram estocadas em meio Batata-P a 4ºC, além de serem estocadas a -20°C, em meio líquido LGI-P com extrato de levedura, acrescido de glicerol 30%. B. Caracterização morfológica Para caracterização da morfologia, os isolados foram estriados em placas de Petri com meio LGI-P sólido, com extrato de levedura, e incubados a 28ºC. Após dez dias de cultivo, os isolados foram avaliados quanto ao aspecto morfológico, sendo considerado cor, brilho e produção de goma. C. Produção de levana O teste para comprovar a produção de levana foi realizado em meio ágar nutritivo-sacarose, como o meio LGI-P sólido com extrato de levedura é um meio nutritivo rico em sacarose, ele foi utilizado para esta identificação, segundo Mariano [7]. Os isolados foram repicados em forma de estrias e incubados a 28ºC por dez dias, e, em seguida, avaliados. Resultados A. Isolamento Durante os experimentos de isolamento em meio LGI-P, seletivo para G. diazotrophicus, foram obtidos 52 isolados bacterianos de caules e raízes de plantas de mandioca cultivada em Pernambuco, destes 22 foram isolados do caule e 30 da raiz, como mostra a Figura 1A. B. Caracterização morfológica Quanto à morfologia, os isolados foram classificados em dois grupos morfológicos: i) cor laranja e aspecto brilhoso e gomoso; e ii) cor laranja seco e sem goma, semelhante a G. diazotrophicus neste meio de cultura. C. Produção de levana Foi observado que 46% das bactérias endofíticas da mandioca, produziram levana, em diferentes intensidades. Esta produção evidenciou-se pela formação de colônias grandes, mucóides e elevadas, colônias achatadas e secas caracterizaram o teste negativo, como mostra a Figura 1-B e a Figura 1-C mostra a freqüência de bactérias produtora e não produtoras de levana. Discussão De acordo com Mendes [8], a densidade populacional bacteriana no colmo de cana-de-açúcar é várias ordens de magnitude menor do que em raízes, da mesma maneira isto ocorre com relação aos isolados de mandioca, a freqüência é maior na raiz qe no caule. Este fato na maioria dos casos é devido ao maior contato raiz-solo, que facilita a entrada das bactérias. Como mostra Dobereiner et al. [6], a característica morfológica de G. diazotrophicus são colônias pequenas, de cor laranja e seca, indicando que os isolados com esta característica provavelmente venham a ser esta espécie bacteriana. É importante ressaltar que não foi encontrado, até o momento, trabalhos que identifiquem a presença de G. diazotrophicus em mandioca. De acordo com Menéndez et al. [4], a produção de levana é proporcionada pelo gene lsdB, que pode estar inativo em alguns casos. Mostrando que os isolados produtores de levana obtidos neste trabalho podem estar com esse gene ativo. Referências [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] SUZIKI, Marise Tanaka. 2006. Isolamento, identificação,e caracterização de linhagens endofíticas de Bacillus thurnigiensis de mandioca (Manihot esculenta Crantz). São Paulo. 102p. Dissertação em Biotecnologia. Universidade de São Paulo – Instituto Butantan – Instituto de Pesquisas Tecnológicas. IBGE - Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. 2009. http://www.ibge.gov.br/home/estatistica/economia/agropecuaria/esta tisticas_previsao_safras/default.shtm. (acessado em 10/09/09). ROSENBLUETH, M.; MARTINEZ-ROMERO, E. 2006. Bacterial endophytes and their interactions with hosts. Molecular Plant and Microorganisms Interactions, 8: 827-837. MENÉNDEZ, C.; HERNÁNDEZ, L.; BANGUELA, A.; PAÍS, J. 2004. Functional production and secretion of the Gluconacetobacter diazotrophicus fructose-releasing exo-levanase (lsdB) in Pichia pastoris. Enzyme and Microbial Technology, 34: 446–452. STURZ, A.V.; CHRISTIE, B.R.; NOWAK, J. 2000. Bacterial endophytes: potential role in developing sustainable systems of crop production. Critical Reviews in Plant Sciences, 19: 1-30. DÖBEREINER, J.; BALDANI, V.L.D.; BALDANI, J.I. 1995. Como isolar e identificar bactérias diazotróficas de plantas nãoleguminosas. Brasília: EMBRAPA-CNPAB, Itaguaí-RJ, 60p. MARIANO, R.L.R. 2000. Manual de práticas em fitobacteriologia. Recife: O autor, p. 81-82. MENDES, R. 2008. Diversidade e caracterização genética de comunidades microbianas endofíticas associadas à cana-deaçúcar. Piracicaba, SP. 121p.:il. Tese (Doutorado em Agronomia). Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz – Universidade de São Paulo. Figura 1. A) Freqüência relativa (%) de isolados bacterianos endofíticos em relação ao tecido vegetal de plantas de mandioca; B) Padrões do teste de produção de levana, sendo I: Positivo; II: Negativo; C) Freqüência relativa (%) de isolados produtores de levana.