Trabalho - SOVERGS

RESPOSTA CELULAR SOBRE EXSUDATO INFLAMATÓRIO EM PIARACTUS
MESOPOTAMICUS APÓS BLOQUEIO ENZIMÁTICO DA CICLOXIGENASE
CELULAR RESPONSE ON INFLAMMATORY EXSUDATE IN PIARACTUS
MESOPOTAMICUS AFTER ENZIMATIC BLOCK OF CICLOXIGENASE
Flávio Ruas de Moraes1, Gustavo S. Claudiano1, Thalita R. Petrillo1, Marcello P. de Castro1,
Hurzana de Mello1, Wilson G. Manrique1, Marco A. de A. Belo1, Julieta E. R. de Moraes1.
Departamento de Patologia Animal, FCAV - Campus Jaboticabal.
([email protected]) Universidade Estadual Paulista FCAV - Jaboticabal, CEP 14884900.
RESUMO
Nesta investigação avaliou-sea cinética do acúmulo de células na aerocistite induzida pela
inoculação da Aeromonas hydrophila inativada em Piaractus mesopotamicus, submetidos a
inibição enzimática da ciclooxigenase na inflamação aguda. Para isso, foram utilizados 54
pacus distribuídos aleatoriamente em nove aquários, contendo seis animais cada. O
meloxicam foi aplicado por via parenteral, 30 minutos antes do estímulo lesivo e após seis, 24
e 48 horas foram feita a coleta e analise do exsudato. Observou-se que o máximo do acúmulo
celular ocorreu 24 horas após o estímulo (HPE), quando o acúmulo de células estava bloqueda
pela ação do AINE. Na contagem diferencial, verificou-se acúmulo de linfócitos, trombócitos,
seguido de macrófagos e granulócitos. Alterações causadas pelo efeito do fármaco sugerem
que em peixes a inflamação aguda é mediada por eicosanóides como as prostaglandinas.
PALAVRA-CHAVE: mediadores químicos, prostaglandinas, meloxicam, exsudato, peixes.
ABSTRACT
This investigation evaluated the kinetics of inflammatory cell accumulation in aerocistite
induced by the inoculation of inactivated Aeromonas hydrophila in Piaractus
mesopotamicus,submitted to cyclooxygenase inhibition in acute inflammation.54 pacus were
randomly distributed in nine tanks, with six fish each, meloxicam was administered
intravenously 30 minutes before the injurious stimulus. In times of six, 24 and 48 hours after
the stimulus (HAS) werecollected and analyzed the exudate.The maximum cell accumulation
occurred 24 HAS, in this period the animals had pre-treatment blocked the migration by the
action of NSAID. In the differential count, it was observed the accumulation of lymphocytes,
thrombocytes, followed by macrophages and granulocytes. Changes caused by the effect of
the drug in fish suggest that acute inflammation is mediated by eicosanoids such as
prostaglandins.
Keywords: chemical mediators, prostaglandins, meloxicam, exudate, fish.
A inflamação é a reação do organismo contra agressões por agentes biológicos, físicos
e químicos (KUMAR, 2004). É um fenômeno multimediado e complexo, no qual seus sinais
podem ser interpretados como a manifestação dos efeitos farmacológicos de várias
substâncias endógenas, particularmente as derivadas do ácido araquidônico.
Entre os protocolos experimentais empregados para elucidação dos processos
inflamatórios, incluem-se os bloqueios com os anti-inflamatórios não esteróidais, que embora
possuam diferentes estruturas químicas, agem fundamentalmente pela inibição da enzima
ciclooxigenase (COX) de metabolização do ácido araquidônico. O meloxican, do grupo dos
oxicans, inibe seletivivamente COX-2, inibindo esta via de metabolização em mamíferos
(OGINO, 1997).
Pouco se conhece da inflamação empeixes ao contrário de outros filos. Sendo assim,
este ensaio teve por objetivo avaliar o efeito do meloxicam (MEL) na inflamação aguda no
sentido de avaliar a participação de eicosanoides no processo .
Para isso foram utilizados pacus, distribuídos aleatoriamente em nove aquários,
totalizando 54 peixes, 6 seis por aquário. Para aplicação do estímulo lesivo utilizou-se 0,5 mL
de solução fisiológica a 0,65% (controle N= 18) e o outro grupo (desafio N= 36) o mesmo
volume dessa solução utilizando como veículo para inocular 3 x 109 UFC de A. hydrophila
inativada pelo calor, os estímulos foram aplicado na bexiga natatória anterior. Para o grupo
pré-tratado com o anti-inflamatório, 30 min antes da aplicação do estímulo inflamatório, foi
injetado por via intramuscular MEL (sete mg/kg). O acúmulo de células totais foi avaliado
após seis, 24 e 48 horas, após o estímulo quando a bexiga natatória foi lavada com 0,5 ml de
solução gelada de PBS, contendo EDTA a 0,09%. O mesmo volume injetado foi recolhido
com o auxilio de seringa descartável. O exsudato foi centrifugado a 1000 rpm, por cinco min.
O sobrenadante foi desprezado e o sedimento total foi ressuspendido com a adição de 100
microlitros de água destilada, onde uma alíquota desse volume foi transferida para câmara de
Neubauer para contagem das células inflamatórias totais em microscopia de luz. Para a
contagem diferencial trombócitos, linfócitos, macrófagos e granulócitos, foi colocada uma
gota deste exsudato sobre lâmina histológica, juntamente com uma gota de soro de pacu,
extraído no dia anterior, seguida feito à estensão do exsudato. As lâminas foram coradas
pancromicamente com corante May-Grunwald-Giemsa-Wrigth, para posterior contagem em
microscopia de luz de até 100 células dentre os diferentes tipos acumulados no foco
inflamatório. Analise estatística, utilizou-se teste de Tukey 5%.
A contagem de células totais no exsudato inflamatório de pacus do grupo controle
positivo revelou aumento no número de células em relação ao grupo controle negativo em
todos os tempos estudados, sendo inclusive significativamente maior (P<0,05), nos tempos de
24 e 48 HPE. Observou-se que com a evolução do processo inflamatório houve aumento
progressivo na contagem celular do exsudato de peixes não tratados e os desafiados com a
bactéria, havendo um acúmulo maior com 24 horas pós-desafio (HPD). Neste tempo verificase que nos grupos tratados com MEL a contagem de células foi estatisticamente menor
(P<0,05) comparado com o grupo controle (Tab.1).
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Tab 1 - Valores médios (respectivos desvios padrão) e análise de variância para contagem total de células, Granulócitos, Trombócitos , Linfócitos
Monócitos e o efeito do Meloxicam na aerocistite induzida pela A. hydrophila .
Variáveis
Tempos
seis horas
24 horas
48 horas
Tratamento
Células Totais
Granulócitos
Controle negativo
583 ± 340
Ba
80 ± 39
1087 ± 214
223,6 ± 67
Meloxicam
1936 ± 178
Bb
Aa
Controle negativo
Controle positivo
671 ± 327 Ca
3073 ± 1283 Aa
121,6 ± 58,5 Ca
442,8 ± 280 Aa
152 ± 70 Ca
1019 ± 354 Aa
286 ± 176
1160 ± 635
Meloxicam
2012 ± 1200 Ba
300 ± 174 Aa
566,8 ± 287 Ba
813 ± 286
Ca
Ba
Controle negativo
770 ± 253
Controle positivo
Meloxicam
1607 ± 663
1254 ± 705
ABb
BCb
ABa
Aa
179 ± 91
316,4 ± 83 ABab
429,4 ± 101 Aa
242,7 ± 63
Ca
Linfócitos
Controle positivo
264,5 ± 95
Ba
Trombócitos
337 ± 117 BCb
472,2 ± 47
ABa
136 ± 42
Aab
250,6 ± 65
160 ± 23
ABb
ABb
Monócitos
200 ± 83
Ba
63,5 ± 20
394 ± 81
Bb
Aa
132 ± 35
941 ± 127
Ca
Aa
Bab
261,5 ± 58
Ba
ABb
Aa
111,6 ± 53,6 Ca
449,8 ± 306 Aa
354 ± 214
ABa
363 ± 120
Ba
94,67 ± 64
Ca
673 ± 98
379 ± 59
ABb
ABb
361,2 ± 118
286,8 ± 78
ABa
Ba
1
M édias (n=6) seguidas de pelo menos por uma letra em comum não diferem pelo teste de Tukey (P>0,05).
Letras maiúsculas comparam na coluna os diferentes tratamentos dentro de cada período, enquanto as letras minúsculas comparam na linha a evolução do processo inflamatório
entre os diferentes dias experimentais.
3
Controle negativo - injetado com 0,5 ml de solução de NaCl 0,65%; Controle positivo - injetado com A. hydrophila; M eloxicam injetado 7 mg/kg
2
A contagem diferencial constatou-se predomínio de linfócitos, trombócitos, seguido de
granulócitos e macrófagos, nos animais tratados houve significativo efeito do MEL sobre a
resposta de linfócitos e trombócitos em relação ao grupo controle positivo .
A avaliação do acúmulo de células no foco inflamatório demonstrou que após a
inoculação da A. hydrophila, ocorreu inflamação. Os resultados, ora encontrados, demonstram
2
que, após o estímulo inflamatório, determina-se um aumento da migração celular para o local
da injúria, atingindo valores máximos 24 HPE, diminuindo-se, posteriormente, corroborando
com BOZZO et al. (2007) e MARTINS et al. (2000, 2007). A redução do acúmulo de células
nos animais tratados com anti-inflamatório ocorre devido ao bloqueia da ciclooxigenase,
permitindo dizer que as prostaglandinas têm participação relevante nos eventos celulares que
ocorrem no processo inflamatório em pacus.
Os resultados da contagem diferencial mostraram amplo predomínio de trombócitos e
linfócitos seguidos de granulócitos e macrófagos, não tratados e inoculados com bactéria,
corroborando parcialmente com BOZZO et al. (2007) e CASTRO et al. (2008). Estes
resultados nos mostram que em estágios iniciais da maioria dos processos inflamatórios as
células predominantes no foco inflamado são os trombócitos e os linfócitos, com o passar do
tempo surgem macrófagos e granulócitos. Em mamíferos atribui-se o retardo do surgimento
de mononucleares sua menor velocidade de migração e à vida média mais curta de
granulócitos (24 horas) (KUMAR et al., 2004).
Nos animais tratados com meloxicam o macrófago e granulócitos não apresentaram
diferença significativa em relação aos animais desafiados com bactéria e não tratados, tal fato
pode ser explicado, pois o meloxicam possui atividade de inibição competitiva reversível
rápida e seletiva para COX-2 (HAKAN et al., 2008; GILMAN et al., 2010), fazendo com que
a inibição seja de um modo mais curto e de menor intensidade.
Concluiu-se assim que em peixes assim como em mamíferos os eicosanóides
participam dos fenômenos vasculares e celulares, tendo relevância na quimiotaxia dos
leucócitos na aerocistite induzida pela A. hydrophila em Piaractus mesopotamicu.
AGRADECIMENTOS
À Fundo de Ampara a Pesquisa do Estado de São Paulo, FAPESP (Proc. 2009/161788).
REFERÊNCIAS
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M.; ONAKA, E. M. Kinetics of cellular component in inflammatory response induced by
different stimuli in the swim bladder of Piaractus mesopotamicus, HOLMBERG, 1887
(characidae). Journal of the World Aquaculture Society, Baton Rouge, v. 38, n. 2, p.302-308,
2007.
CONTRAN; KUMAR, V.; ABBAS, A. K.; FAUSTO, N. Patologia – Bases Patologicas das
Doenças. 4ª. Elsevier., 49pp. 2004.
GILMAN A.G.; The Pharmacological Basis of Therapeutics. 11ª, Guanabara e Koogan, 395
pp. 2010.
HAKAN T.; BERKMAN M.Z; ERSOY T.; KARATAS I.. Anti-inflammatory effect of
meloxicam on experimental vasospasm in the rat femoral artery. Journal of Clinical
Neuroscience v.15, p.55–59, 2008.
MARTINS, M. L.; MORAES, F. R.; FUJIMOTO, R.Y.; ONAKA, E. M.; BOZZO, F. R.;
MORAES, J. R. E. Carragenin induced inflammation in Piaractus mesopotamicus
(Osteichthyes: Characidae) cultured in Brazil. Boletim do Instituto de Pesca, São Paulo, v. 32,
n. 1, p. 31-39, 2007.
MARTINS, M.L.; MORAES, F.R.; MORAES, J.R.E.; MALHEIROS, E.C. Falha na resposta
do cortisol ao estresse por captura e por carragenina em Piaractus mesopotamicus Holmberg,
1887 (Osteichthyes: Characidae). Acta Scientiarum, 22 (2), 545-552, 2000
OGINO K, HATANAKA K, KAWAMURA M, et al. Evaluation of pharmacological profile
of meloxicam as an anti-inflammatory agent, with particular reference to its relative
selectivity for cyclooxygenase-2 over cyclooxygenase-1. Pharmacology; 55:44–53, 1997.
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