1 Amplificação cruzada de primers SSR para a espécie

Anais do IX Seminário de Iniciação Científica, VI Jornada de Pesquisa e Pós-Graduação
e Semana Nacional de Ciência e Tecnologia
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS
19 a 21 de outubro de 2011
Amplificação cruzada de primers SSR para a espécie Cichla kelberi (Tucunaré
amarelo) do reservatório Serra da Mesa – Goiás
Ramilla dos Santos Braga (UEG)
Thaís Guimarães de Castro (UFG)
Mariana Pires de Campos Telles (UFG)
Samantha Salomão Caramori (UEG)
[email protected]
Introdução
A evolução da biotecnologia possibilitou o avanço de várias técnicas na área da
Genética, pois facilitou os estudos ainda escassos de espécies importantes da nossa
fauna e flora (Ferreira & Gratapalia, 1998). Dentre estas técnicas existem os marcadores
moleculares que são ferramentas eficazes no conhecimento do genoma das espécies,
permitindo várias pesquisas que funcionam como mecanismos de ações que auxiliam no
conhecimento genético dos espécimes e consequentemente em planos de conservação
da espécie (Artoni & Matiello, 2003).
Dentre os maçadores genéticos podemos destacar os microssatélites, também
conhecidos como SSR (Simple Sequence Repeat), que são regiões genômicas
caracterizadas por repetições de bases organizadas em tandem e em motivos de di, tri ou
tetranucleotídeos (Ferreira & Gratapalia, 1998). Este tipo de marcador molecular é
bastante usado em estudos genéticos, pois é capaz de identificar diferenças nas regiões
homológas entre as espécies, ou seja, nos fornece informações acerca da diversidade
gênica dos indivíduos de determinada população. São definidos por corresponderem às
regiões altamente repetitivas, com expressão codominante, multialelismo, além de
serem abundantes e reproduzíveis. Também apresentam a vantagem de transferibilidade
em outros genomas, podendo ser encontrados tantos em regiões de transcrição e neutras
do DNA e serem baseados na técnica de PCR (polymerase chain reaction), técnica
marcada pela facilidade de reprodução e confiabilidade dos dados (Gasic et al., 2009;
Matioli & Passos-Bueno, 2001).
Limitações como, o grande investimento financeiro e profissional estão
envolvidas na aplicabilidade e desenvolvimento dos marcadores SSR específicos para
cada espécie (Ferreira & Grattapalgia, 1998). Felizmente, os microssatélites são regiões
nucleotídicas conservadas em genomas de espécies relacionadas evolutivamente o que
possibilita a transferibilidade de marcadores SSR entre espécies ou em nível superior,
como no caso de gêneros diferentes, mas da mesma família (Caixeta, 2006). O processo
de transferibilidade é baseado na similaridade genética das espécies, considerando a
homologia das regiões flanqueadoras das sequências de microssatélites (Oliveira et. al,
2006).
Neste contexto o grupo biológico mais representativo dos vertebrados, a
ictiofauna é bastante estudada geneticamente, pois através do processo de
transferibilidade muitos gastos são reduzidos e ao mesmo tempo possibilita a
compreensão da estruturação gência de populações próximas evolutivamente. A
abundância de espécies neotropicais de habitat dulcícola favorece a existência de
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trabalhos que busquem amenizar diversos impactos causados a estas que são
constantemente ameaçadas por exploração inadequada do ecossistema em que são
inseridas (Agostinho, 2007) e a construção de reservatórios desponta neste aspecto por
constituir-se um bloqueio físico ás atividades biológicas desenvolvidas pelas espécies
existentes no ambiente aquático ou que dele dependem (Agostinho, 2007; Luiz et al.,
2003).
No lago Serra da Mesa pode ser encontrada a espécie de tucunaré, Cichla kelberi
(Kullander & Ferreira, 2006), conhecido pela sua cor amarelo, podendo ser empregado
em várias utilidades pesqueiras. Este peixe exibe comportamento sedentário que
estimula o desenvolvimento de populações distintas ecologicamente e geneticamente ao
longo do reservatório (Oliveira et al., 2008). Dessa maneira o objetivo deste trabalho é
testar a amplificação cruzada de locos microssatélites desenvolvidos para várias
espécies da ictiofauna no genoma de Cichla keberi, encontrada no lago artificial Serra
da Mesa.
Objetivo geral
Testar a amplificação cruzada de locos microssatélites desenvolvidos para várias
espécies da ictiofauna no genoma de Cichla keberi, encontrada no lago artificial Serra
da Mesa.
Objetivos específicos
Identificar locos heterólogos que possam ser usados em estudos genéticopopulacionais da espécie Cichla kelberi;
Analisar se há amplificação cruzada de locos heterólogos de espécies de peixes
de ordens diferentes da espécie em estudo;
Caracterizar os locos que foram transferidos para espécie Cichla kelberi,
verificando a presença ou não de polimorfismo;
Fornecer informações acerca da genética da espécie Cichla kelberi, associando a
fatores ecológicos.
Material e métodos
As coletas foram realizadas no período de 2009-2010 no reservatório Serra da
Mesa, totalizando três coletas. A coleta dos indivíduos foi feita em seis pontos amostrais
localizados próximos à jusante dos seguintes afluentes: Rio Bagagem, rio Maranhão,
Rio Tocantizinho e Rio Traíras, em que foram armadas redes de espera de diferentes
malhas, 2.4, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 e 16 cm, permanecendo 24 horas em cada ponto. Para
aumentar o número de indivíduos capturados foi utilizada a metodologia de pesca
comum (com vara e isca artificial).
A extração de DNA dos indivíduos coletados seguiu o protocolo descrito por
Taggart et al., (1992), com as etapas de maceração do tecido usando STE e precipitção
do DNA com cloreto de sódio e etanol.
Logo após a etapa de extração de DNA houve a quantificação das amostras em
gel de agarose 1% com o uso do marcador molecular Low DNA Mass Ladder
(Invitrogen™), corado com brometo de etídeo (Lima et al., 2008), para posteriormente
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realizar a diluição das amostras para prosseguir com as outras etapas. A reação de PCR
das amostras procedeu num termociclador em que consistiu-se das seguintes fases:
desnaturação, anelamento e extensão das moléculas de DNA com temperatura inicial de
94°C a 5’, 30 ciclos de 94°C a 1’, X°C a 1’, 72°C a 1’ e 72°C a 7’.
Para o processo de amplificação cruzada 26 locos desenhados para as espécies
Cichla piquiti, Prochilodus argenteus, Piaractus mesopotamicus foram testados no
genoma de Cichla kelberi. Os produtos de amplificação foram visualizados em
eletorforese vertical em poliacrilamida 6% e corado com nitrato de prata e uso do
marcador molecular 10 bp.
Para as análises da heterozigosidade esperada e observada, probabilidade de
exclusão de paternidade (Q), definida como a exclusão de uma falsa paternidade, a
probabilidade de identidade genética (I), que avalia se os genótipos de dois indivíduos
escolhidos aleatoriamente são idênticos foi utilizado o programa Identity 1.0 (Wagner &
Sefc, 1999).
Resultados e Discussão
As temperaturas de anelamento dos 26 locos avaliados variaram entre 44 e 62º
C. Até o momento, quatro apresentaram sucesso de amplificação cruzada para Cichla
kelberi, e foram padronizados com as temperaturas de anelamento 54º C (Tuc 4, Tuc
16) e 56º C (Tuc 11 e Tuc 10). Os outros locos não apresentaram amplificação cruzada,
portanto não foram analisados em todos os indivíduos da população coletados.
Considerando os três indivíduos do teste inicial, os alelos obtidos apresentaram os
seguintes tamanhos: 195 pb (Tuc 4), 185 pb (Tuc 10), 168 pb (Tuc 11) e 212/220 pb
(Tuc 16).
Para verificar se houve realmente transferibilidade genética, os locos
amplificados nos testes foram analisados na população com 21 indivíduos, coletados em
pontos aleatórios do reservatório Serra da Mesa. Os locos Tuc 4, Tuc 11 e Tuc 10 foram
monomórficos e apenas o Tuc 16 teve polimorfismo na população. A variação de alelos
por loco foi baixa, pois apenas no loco Tuc 16 foram encontrados dois alelos.
A heterozigosidade esperada (He) e heterozigosidade observada (Ho) foram de
zero para os locos Tuc 4, Tuc 10, Tuc 11 devido estes locos serem monomórficos. O
conjunto de locos não oferece informações acerca da diversidade genética das
populações, pois os locos Tuc 4, Tuc 10 e Tuc 11 podem enviesar os resultados,
mascarando regiões variáveis do genoma (Lima et al., 2008). A He e Ho foram de 0,42
e 0,38, respectivamente, para o Tuc 16. Assim, este loco está próximo do Equilíbrio de
Hardy-Weinberg, indicando que as freqüências alélicas e genotípicas para este loco são
estáveis para os indivíduos testados.
Os baixos níveis de heterozigosidade observada provavelmente têm relação com
o efeito fundador, processo ecológico e genético, causado pela formação recente do
reservatório Serra da Mesa. Este efeito pode ter sido ocasionado quando o represamento
iniciou-se, em que as espécies de tucunaré, tanto Cichla kelberi e Cichla piquiti, eram
encontradas no baixo Rio Tocantins (Lima & Souza, 2010), o qual é um dos integrantes
do reservatório. Em resumo, este processo recruta poucos indivíduos para formar uma
nova população, levando a fixação de alguns alelos nesta e consequentemente, a baixa
variabilidade genética, provocada pela endogamia, resultante do efeito fundador (Aho,
et al., 2006; Freitas & Galetti Jr, 2005).
Ao contrário do que ocorreu no trabalho de Carvalho et al.(2009), em que a
amplificação cruzada de regiões genômicas de Cichla piquiti para Cichla kelberi
apresentou-se bastante satisfatória, neste trabalho o sucesso da transferibilidade é
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inferior a 50%. Este fato é bastante interessante pela questão que as espécies de
tucunaré que compõem o lago Serra da Mesa são do mesmo gênero e mesma família.
Assim, era esperado que a maioria dos locos testados fosse transferida para o genoma de
Cichla kelberi, aumentando o número de primers que podem ser usados em estudos
genético-populacionais da espécie.
Uma possível explicação para este fato é que a espécie Cichla kelberi pode
apresentar regiões microssatélites diferentes daquelas já amplificadas para o genoma de
Cichla piquiti. Essas diferenças podem ser ocasionadas por crossing over, slippage
(erros da enzima da DNA polimerase), originando microssatélites de tamanhos
diferentes que impedem a amplificação cruzada (Borém & Caixeta, 2009).
Em relação aos locos desenvolvidos para as espécies Prochilodus argenteus e
Piaractus mesopotamicus e a não transferibilidade destes locos no genoma de Cichla
kelberi pode ser associada à distância evolutiva destas espécies com a espécie analisada,
evidenciada pela classificação taxonômica das espécies, em que Prochilodus argenteus
e Piaractus mesopotamicus pertencem à ordem Characiforme enquanto Cichla kelberi é
incluído na ordem Perciforme (Caixeta, 2006).
Conclusão
Com a baixa taxa de transferibilidade encontrada para a espécie Cichla keberi
sugere-se que sejam feitos mais estudos relacionadas à genética deste peixe para que se
tenham marcadores moleculares que propiciem informações mais robustas sobre a
dinâmica genética populacional e ecológica de Cichla kelberi em ambientes naturais e
introduzidos. Além que, com este trabalho podemos conhecer dados acerca da genética
desta espécie, propiciando a realização de mais estudos genético-populacionais que
possa aferir mais sobre a presença desta em espécie.
Agradecimento
Agradeço a Pró-Reitoria de Pesquisa e Extensão da Universidade Estadual pela
bolsa de iniciação científica, concedida durante o período de um ano para a execução
deste trabalho. Também agradeço ao Laboratório de Genética e Biodiversidade da
Universidade Federal de Goiás pela infra-estrutura, a Naturae, empresa pela qual são
financiados projetos neste laboratório e que contribuiu financeiramente para a realização
dos experimentos. Ao IBAMA pela toda logística empregada durante as coletas em
campo.
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