identificação do projeto - pibic

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
DIRETORIA DE PESQUISA
PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC
: CNPq, CNPq/AF, UFPA, UFPA/AF, PIBIC/INTERIOR, PARD, PIAD, PIBIT, PADRC E
FAPESPA
RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO
Período : __08____/____2014______ a _____07____/____2015______
( ) PARCIAL
(x) FINAL
IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO
Título do Projeto de Pesquisa (ao qual está vinculado o Plano de Trabalho):
Programa de cooperação técnico-científico na área de biotecnologia da reprodução entre
a Universidade Federal do Pará (UFPA) e a Universidade Norte do Paraná (UNOPAR).
Nome do Orientador: Otavio Mitio Ohashi
Titulação do Orientador: Doutor
Instituto/Núcleo: Instituto de Ciências Biológicas
Laboratório: Laboratório de Fecundação In vitro
Título do Plano de Trabalho : AVALIAÇÃO DA DESCONDENSAÇÃO DA
CROMATINA ESPERMÁTICA, ATRAVÉS DA CROMOMICINA A3, APÓS
FECUNDAÇÃO IN VITRO DE OÓCITOS BOVINOS
Nome do Bolsista: Caroline de Araújo Santos
Tipo de Bolsa :
(x) PIBIC/ CNPq
( ) PIBIC/CNPq – AF
( )PIBIC /CNPq- Cota do pesquisador
( ) PIBIC/UFPA
( ) PIBIC/UFPA – AF
( ) PIBIC/ INTERIOR
( )PIBIC/PARD
( ) PIBIC/PADRC
( ) PIBIC/FAPESPA
( ) PIBIC/ PIAD
( ) PIBIC/PIBIT
1
1.
INTRODUÇÃO
A produção in vitro de embriões (PIVE) é uma biotécnica que vem sendo
destacada no cenário atual e compreende as etapas de maturação in vitro (MIV),
fecundação in vitro (FIV) e cultivo in vitro (CIV), onde ocorrerá o desenvolvimento até o
estágio de blastocisto (GONÇALVES et al., 2002). As dificuldades encontradas no
processo de PIVE ocorrem devido a dificuldades em se mimetizar os diversos ambientes
no qual essas etapas acontecem in vivo (MEIRELLES et al. 2004).
Com o intuito de continuar aperfeiçoando este processo grande parte dos
estudos é voltada para compreensão e melhoramento do oócito in vitro, porém há
também a necessidade de pesquisas voltadas para o gameta masculino, já que a sua
integridade a nível molecular e morfológico é de extrema necessidade para a
fecundação do gameta feminino, formação e desenvolvimento do embrião (WOLF,
2005), já que danos no material genético do espermatozóide afetam diretamente a etapa
de iniciação da expressão gênica embrionária, que ocorre a partir do estágio de 8
células. (FATEHI et al., 2006).
A primeira etapa do desenvolvimento embrionário é a fecundação. Antes
desse processo, o DNA do gameta masculino se encontra bastante compactado por
proteínas específicas chamadas de protaminas (KNOBIL & NEIL, 1993). Entre os
mamíferos, a estrutura e a composição da cromatina somática varia, já que o DNA não
está relacionado com histonas ou nos nucleossomos (MCLAY E CLARKE, 2003).
Entre as mudanças bioquímicas que ocorrem durante a fecundação,
destacam-se as que ocorrem no núcleo do espermatozóide, principalmente a
substituição que ocorre na cromatina espermática, onde as protaminas serão
substituídas pelas proteínas nucleares de células somáticas, as histonas (NAKAZAWA
et al., 2002).
Um método eficiente para avaliar a protaminação do material genético seria
a coloração com Cromomicina A3, que tem a sua correlação com a protamina
1/protamina 2 descrita em diversos estudos recentes, sendo apontada como o método
mais prático para este tipo
de avaliação (GEORGIOU, 1996, LOLIS et al, 2006.,
ANGELOUPOULOU et al, 2007, ZANDEMANI et al, 2012).1
Alguns
trabalhos
têm
mostrado
que
a
integridade
da
cromatina
do
espermatozóide durante a fecundação pode decisivamente influenciar a sobrevivência
embrionária, status este que envolve vários processos bioquímicos, morfológicos e
2
fisiológicos que ocorrem durante tal processo e que estão associados com mudanças
marcantes na estrutura da cromatina do espermatozóide, como a substituição das
protaminas por histonas (NAKAZAWA et al., 2002; D’OCCHIO et al, 2007), as quais
estão envolvidas na regulação da organização cromossômica e transcrição de genes,
sendo encontradas em vários subtipos que são expressos na maturação do oócito e no
desenvolvimento embrionário (YUN et al, 2012).
Sendo assim, o principal objetivo deste trabalho visa descrever a relação de
problemas relacionados à troca da protamina pela histona oocitária e sua possível
influência no bloqueio do desenvolvimento do embrião, utilizando a coloração com
Cromomicina A3 como principal ferramenta detecção, servindo para futuros estudos
futuros na espécie bovina.
.
2. JUSTIFICATIVA
Ainda não há a completa compreensão dos mecanismos que causam a
remodelação da cromatina espermática durante a fecundação, e isto seria de extrema
importância não só para os estudos neste ramo, como para a melhoria das taxas de
embriões com origem em técnicas como a fecundação in vitro, a injeção
intracitoplasmática de espermatozóide e a transferência nuclear (NAKAZAWA et al.,
2002)..
Em 2002, NAKAZAWA et. al foram pioneiros em utilizar a técnica de
imunocitoquímica para realização de estudos bioquímicos a respeito da substituição da
protamina pelas histonas em mamíferos, sendo seu primeiro alvo de estudo zigotos de
ovinos,
a única espécie mamífera com relatos a respeito desse processo. A
necessidade de compreender melhor este evento bioquímica torna necessário um maior
aprofundamento dos estudos envolvendo a remodelação nuclear ocorrida durante a FIV
em outras espécies, como por exemplo, bovinos, com o intuito de melhorar a
compreensão e os resultados do desenvolvimento embrionário in vivo.
Assim, a hipótese deste trabalho é que problemas ocorridos durante a
substituição da protamina por histona estejam diretamente ligados ao desenvolvimento
embrionário, e esta pode ser a causa de tamanha discrepância entre as taxas obtidas
em fecundações com sêmen de touros de raças diferentes.
3
3. OBJETIVOS
Objetivo geral
Avaliar a descondensação da cromatina espermática após o processo de
fecundação in vitro em oócitos bovinos.
Objetivos específicos
- Descrever o período em que ocorre a substituição de protamina por histona
durante o processo de fecundação in vitro, na espécie bovina.
- Verificar a presença da protamina, através do fluorocromo cromomicina A3, em
embriões que não desenvolvem ao estágio de blastocisto.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Delineamento experimental
Experimento 1: Analisar a substituição da protamina pela histona nos zigotos
através de CMA3.
Neste experimento foi analisada o processo de substituição da protamina pela
histona até sete (7) horas após a FIV (segundo Nakazawa et al., 2002 e Dean et al.,
2003) através da técnica de imunofluorescência e coloração com Cromomicina A3.
Para isso foi realizada a FIV e prováveis zigotos foram fixados, para análise da
presença de CMA3, nos seguintes intervalos de tempo: 3, 4, 5, 6 e 7 horas após a FIV.
Experimento 2: Analisar a presença da protamina em embriões que não
desenvolvem a blastocisto.
Neste experimento
foi analisado se uma provável falha na substituição de
protamina por histona pode ser a causadora do não desenvolvimento do embrião ao
estágio de blastocisto. Para isso, foi realizada produção in vitro de embriões bovinos e
aqueles que não ultrapassaram o estágio de 2 ou 4 células (que pararam seu
desenvolvimento), no 3° dia de desenvolvimento, foram analisados quanto a presença
da protamina e comparados a embriões com desenvolvimento “normal”.
4
4.2 PRODUÇÃOIN VITRO DE EMBRIÕES
4.2.1 Coleta de Ovários e Punção Folicular
Os ovários foram obtidos no abatedouro local; SOCIPE (Sociedade Cooperativa
dos Pecuaristas), localizado no bairro do Tapanã (Belém – PA), coletados logo após o
abate, lavados em PBS e acondicionados em frasco com solução salina (0,9% cloreto de
sódio) à temperatura de 30 a 35 ºC, sendo transportados ao laboratório de Fecundação
In vitro da Universidade Federal do Pará dentro de um período máximo de 2 horas.
Folículos antrais de 2 a 8 mm foram puncionados utilizando-se agulhas 40 x 12 e
seringas de 10 mL, sendo o fluido folicular obtido depositado em tubos de 15 mL.
Terminada a aspiração, foi possível visualizar o sobrenadante e o pellet (onde se
encontram os complexos cumulus oophorus- CCOs). A porção líquida foi desprezada e o
sedimento transferido para uma placa de Petri estéril de poliestireno de 60 mm de
diâmetro.
4.2.2 Rastreamento e Seleção dos CCOs
O rastreamento dos CCOs foi realizado com auxílio de lupa estereomicroscópica,
utilizando-se de tubo capilar, sob o fluxo laminar. Os CCOs com citoplasma homogêneo,
sem vacúolos ou grânulos escurecidos, apresentando células do cumulus oophorus
compactas e refringentes foram lavados e selecionados em TCM 199 Hepes acrescido
10% de SFB (v/v), 0,22 mM piruvato, 62,6 g/mL penicilina e 50 g/mL gentamicina
(TCM 199-Hepes) e então maturados in vitro.
4.2.3 Maturação In vitro (MIV)
Os CCOs foram incubados, em gotas de 100µL de meio de MIV (Meio TCM 199,
tampão bicarbonato de sódio, suplementado com 10% SFB (v/v), 0,5µg/mL FSH,
50µg/mL LH, 0.5µg/mL EGF, 22µg/mL de piruvatoe 50µg/mL de gentamicina) em placas
de petri de 35 mm sob óleo mineral estéril, por um período de aproximadamente 20
horas sob atmosfera de 5% de CO2, 20% de O2, 75% de N2 e temperatura de 38,5°C.
5
4.2.4 Fecundação In vitro (FIV)
Para a fecundação in vitro foi utilizado sêmen congelado de um único touro
Simental (Bos taurus). O método de separação dos espermatozóides (SPTZ) dos
crioprotetores e plasma seminal foi o de gradiente de densidade descontínuo de Percoll.
A mini-palheta (500 µl) de sêmen foi descongelada em água a 35 ºC durante 30
segundos e, em seguida, o sêmen foi depositado sobre a coluna de 800L de Percoll
(400L gradiente 45% e 400L gradiente 90%) e centrifugado a 200 g durante 7
minutos. O sobrenadante foi desprezado e o pellet lavado em 800 µl de meio de
fecundação (TALP suplementado com 10 µg /mL de heparina, 2 µM de penicilamina, 1
µM de hipotaurina, 0,25 µM de epinefrina e 6 mg/mL BSA) por centrifugação a 200 g
durante 3 minutos para remoção dos resíduos de Percoll.
Após as lavagens, a concentração espermática foi determinada com auxílio de
uma câmara de Neubauer e ajustada para 2x10 6 SPTZ/mL. Os espermatozóides foram
colocados em gotas de 80 L de meio de fecundação (TALP, suplementado com 10
µg/mL de heparina, 2 µM de penicilamina, 1 µM de hipotaurina, 0,25 µM de epinefrinae 6
mg/mL BSA), junto com os CCOs (20 a 25 por gota). CCOs e espermatozóides
permaneceram co-incubados em placas de petri sob óleo mineral estéril, até o período
em que os zigotos foram fixados para o experimento 1 ( 04 a 08 horas após a FIV), ou,
no caso
do experimento 2, após 24 horas de FIV. Os prováveis zigotos foram
submetidos a sucessivas pipetagens para retirada das células do cumulus oophorus
restantes e dos espermatozóides aderidos à zona pelúcida e então transferidos para a
placa de cultivo in vitro.
4.2.5 Cultivo In vitro (CIV)
Para dar suporte ao desenvolvimento embrionário foi realizado um sistema
de co-cultivo dos embriões bovinos em monocamada de células da granulosa oriundas
do cumulus oophorus dos oócitos, que aderem à placa de cultivo durante a MIV
formando uma monocamada. O meio de MIV foi substituído por 100 L de meio de
cultivo embrionário e a placa com a monocamada permanecendo incubada em estufa de
CO2, aguardando o momento da transferência dos embriões. O meio de cultivo utilizado
foi o meio SOF (sintetic oviduct fluid) suplementado com 6 mg/mL de BSA, 10% de SFB
e antibióticos, segundo TERVITet al. (1972).
Após 24 a 28 horas na gota de FIV, os prováveis zigotos foram submetidos
à sucessivas pipetagens (vortex) para retirada das células do cumulus oophorus
6
restantes e dos espermatozóides aderidos à zona pelúcida, sendo então transferidos (15
a 20) para gotas de cultivo onde permaneceram até o fim do cultivo.
4.2.6 Coloração com Cromomicina A3
Os prováveis zigotos foram lavados duas vezes em PBS em seguida secos ao ar
à temperatura ambiente durante 30 minutos. Cada lâmina foi tratada com 100 mL de
CMA3 em solução durante 20 minutos (Sigma-Aldrich Co, LLC, St. Louis, MO) [0,25 mg /
mL em 0,15 M PBS]. As lâminas foram lavadas em PBS e secas ao ar em temperatura
ambiente. A análise microscópica de lâminas foi realizada usando um microscópio de
fluorescência.
A Coloração CMA3 foi avaliada distinguindo entre os que coraram em verdeamarelo intenso (CMA3 indicando positivamente deficiência de protamina) e aqueles
com coloração verde-amarela fraca (CMA3 indicando protaminação completa) (LOLIS
ET AL, 1996 E ZANDEMANI ET AL. 2012)
5 RESULTADOS
A eficiência do protocolo para uso do fluorocromo CMA3 em zigotos foi testada
através de microscopia de fluorescência. A figura 1 mostra os resultados das amostras
coradas com CMA3 e HOECHST como controle.
A
B
C
Figura 1- Coloração com CMA3 em zigotos que apresentaram bloqueio do desenvolvimento
no terceiro dia de cultivo in vitro. O método de detecção se mostrou ineficaz em zigotos. A)
Zigoto visualizado sob microscopia de luz. B) Zigoto submetido à coloração com CMA3 e
analisado por microscopia de fluorescência C) Zigoto após coloração com HOESCHT como
controle.
7
Apesar das diversas tentativas de padronização do protocolo utilizado em
espermatozóides para utilização em zigotos, não houve resultados para este experimento.
Diversos trabalhos mostram a eficiência deste cromóforo na detecção de deficiências
relacionadas
a
protaminação
(GEORGIOU,
1996,
LOLIS
ET
AL,
2006.,
ANGELOUPOULOU ET AL, 2007) porém, não há relatos deste método aplicado em
zigotos ou em células somáticas cujo objetivo não fosse bandeamento, técnica que já é
comumente usada na literatura (KARAGYAN ET AL, 2012., BOLSHEVA ET AL, 2012.,
ŚLIWIŃSKA-JEWSIEWICKA, 2015) por se ligar aos sítios ricos em Guanina e Citosina,
segundo descrito por Sunmer et al, em 1989.
Mesmo utilizando ferramentas como a digestão enzimática da zona pelúcida,
relatada por Lagutina e colaboradores em 2007, o fluorocromo aparenta não ser hábil a
atravessar a membrana celular do oócito, uma vez que não foi observado nenhum sinal
semelhante ao descrito por Lolis et al (1996) e posteriormente por Zandemani e
colaboradores (2012), onde o material genético masculino deveria apresentar uma
coloração verde-amarelada em diferentes intensidades, tornando possível a identificação
entre positivos e negativos. Outro fator relevante seria o tempo de substituição, uma vez
que trabalhos anteriores realizados pelo Laboratório de Fecundação in vitro indicam que a
substituição da protamina pela histona H1FOO ocorre rapidamente após a fecundação do
oócito, o que também poderia ser responsável pela não detecção da deficiência de
protamina neste experimento.
Deste modo, se tornou inviável a utilização de tal método para a análise de
problemas relacionados à integridade da protamina e sua relação com o bloqueio
embrionário, uma vez que defeitos à nível da integridade molecular do espermatozóide
podem não impedir a fecundação, porém este tipo de dano no DNA permace durante o
desenvolvimento embrionário, podendo também ocasionar erros na substituição da
protamina por histona, fator que pode levar ao bloqueio do desenvolvimento
embrionário,
induzindo
o
embrião
à
apoptose
ou
fragmentação
embrionária
(ELLINGTON et al, 1998), como no caso das amostras utilizadas para este experimento,
armazenadas no terceiro dia do desenvolvimento, onde já deveriam haver clivagens
características deste estádio de desenvolvimento (GONÇALVES, 2002) .
6
PUBLICAÇÕES
Até o presente momento, não houve publicação gerada pelo trabalho.
8
7
CONCLUSÃO:
Não foi possível a detecção das falhas no processo de desconsação
da cromatina espermática através da técnica de coloração pelo flurocromo Cromomicina
A3, possivelmente pela dificuldade encontrada em atravessar a membrana plasmática
oocitária, não fornecendo nenhum resultado concreto sobre a relação entre defeitos
deste evento bioquímico e o bloqueio do desenvolvimento embrionário.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ANGELOPOULOU. R., PLASTIRA, K., MSAOUEL, P.. Spermatozoal sensitive
biomarkers to defective protaminosis and fragmented DNA. Reproductive biology and
endocrinology : RB&E.5:36. doi:10.1186/1477-7827-5-36, 2007
AYRES, M.; AYRES, M.Jr.; AYRES, D.L.; SANTOS, A.S.. BioEstat 5.0:
aplicações estatísticas nas áreas das ciências biológicas e médicas. Belém:
Sociedade Civil Mamirauá, 2007
BOLSHEVA, N. L., GOKHMAN, V. E., MURAVENKO, O. V., GUMOVSKY, A. V.,
& ZELENIN, A. V.. Comparative cytogenetic study on two species of the
genus Entedon Dalman, 1820 (Hymenoptera, Eulophidae) using DNA-binding
fluorochromes and molecular and immunofluorescent markers. Comparative
Cytogenetics, 6(1), 79–92, 2012
CAMARGO, L.S.A.; VIANA, J.H.M.; SÁ, W.F.; FERREIRA, A.M.; RAMOS, A.A.;
VALE FILHO, V.R. Factors influencing in vitro embryo production. Animal
Reproduction, 3: 19-28, 2006.
D, GEORGIOU I, SYRROU M, ZIKOPOULOS K, KONSTANTELLI M, MESSINIS I.
Chromomycin A3-staining as an indicator of protamine deficiency and fertilization .
International Journal of Andrology. Feb;19(1): 23-27, 1996
D’OCCHIO, M.J.; HENGSTBERGER, K.J.; JOHNSTON, S.D. Biology of sperm
chromatin structure and relationship to male fertility and embryonic survival. Animal
Reproduction Science 101 1–17, 2007.
DONG, Y.J.; VARISANGA, M.D.; MTANGO, N.R.; AONO, M.; OTOI, T.; SUZUKI,
T. Improvement of the culture conditions for in vitro production of cattle embryos in a
portable CO2 incubator. Reproduction in Domestic Animals, v. 36, p. 313-318, 2001;
ELLINGTON, J.E.; EVENSON, D.P.; FLEMING, J.E.; BRISBOIS, R.S.; HISS,
G.A.; BRODER, S.J., WRIGHT, R.W. JR. Coculture of human sperm with bovine oviduct
epithelial cells decreases sperm chromatin structural changes seen during culture in
media alone. Fertility and Sterelity. 69(4):643-649, 1998
FATEHI, A.N.; BEVERS, M.M.; SCHOEVERS, E.; ROELEN, B.A.J.;
COLENBRANDER, B.; GADELLA, B.M.. DNA damage in bovine sperm does not block
9
fertilization and early embryonic development but induces apoptosis after the first
cleavages. Journal of Andrology 27: 176–88, 2006.
GONÇALVES, P.B.D.; VISINTIN, J.A.; OLIVEIRA, M.A.L; MONTAGNER, M.M.;
COSTA, L.F.S.. Produção in vitro de embriões. In: Biotécnicas Aplicadas à
Reprodução Animal. 1ª ed., São Paulo: Gonçalves, P. B. D; Figueiredo, J. R. & Freitas,
V. J. F., p. 195- 196, 2002.
KARAGYAN, G., LACHOWSKA, D., & KALASHIAN, M.. Karyotype analysis of four
jewel-beetle species (Coleoptera, Buprestidae) detected by standard staining, C-banding,
AgNOR-banding and CMA3/DAPI staining. Comparative Cytogenetics, 6(2), 183–197.
2012
KNOBIL, E. & NEIL, J. D. The Physiology of Reproduction. Second edition.
Raven Press. 1993.
LAGUTINA, I., LAZZARI, G., DUCHI, R., TURINI, P, TESSARO, I, BRUNETTI, D.,
COLLEONI, S., CROTTI, G., GALLI, C. Comparative aspects of somatic cell nuclear
transfer with conventional and zona-free method in cattle, horse, pig and sheep.
Theriogenology 67, 90-98. 2007
LEEW, A.M.W. Ovum pick up and in vitro production in the bovine after use in
several generations: a 2005 status. Theriogenology, v.62, p. 914-925, 2006;
LOLIS, D., GEORGIOU, I., SYRROU, M., ZIKOPOULOS, K., KONSTANTELLI, M.
and MESSINIS, I., Chromomycin A3-staining as an indicator of protamine deficiency and
fertilization. International Journal of Andrology, 19: 23–27. 1996
MCLAY, D. W. AND CLARKE, H. J. Remodelling the paternal chromatin at
fertilization in mammals. Reproduction 125, 625–633, 2003
MEIRELLES, F. V.; CAETANO, A. R.; 0WATANABE, Y. F.; RIPAMONTE, P.;
CARAMBULA, S. F.; MERIGHE, G. K.; GARCIA, S. M.. Genome activation and
developmental block in bovine embryos. Animal Reproduction Science, 82-83: 13-20,
2004.
NAKAZAWA, Y.; SHIMADA, A.; NOGUCHI, J.; DOMEKI, I.; KANEKO, H. AND
KIKUCHI, K. Replacement of nuclear protein by histone in pig sperm nuclei during in
vitro fertilization. Reproduction 124, 565–572, 2002.
RUMPF, R. Avanços metodológicos na produção in vitro de embriões. Revista
Brasileira de Zootecnia , v.36, suplemento especial, p.229-233, 2007.
SHIMADA, A.; KIKUCHI, K.; NOGUCHI, J.; AKAMA, J.; NAKANO, M.; AND
KANEKO, H. Protamine dissociation before decondensation of sperm nuclei during in
vitro fertilization of pig oocytes. Journal of Reproduction and Fertility, 120, 247–256,
2000.
ŚLIWIŃSKA-JEWSIEWICKA, A., KUCIŃSKI, M., KIRTIKLIS, L., DOBOSZ, S.,
OCALEWICZ, K., & JANKUN, M.. Chromosomal characteristics and distribution of rDNA
sequences in the brook trout Salvelinus fontinalis (Mitchill, 1814). Genetica, 143(4), 425–
432. 2015
SUMNER, A. T. Chromosome banding, in Light Microscopy in Biology (Lacey, A.
J, ed) IRL, Oxford, UK, pp 279–314. 1989
TANAKA, M., KIHARA, M., HENNEBOLD, J.D., EPPIG, J.J., VIVEIROS,
M.M., EMERY, B.R., CARRELL, D.T., KIRKMAN, N.J., MECZEKALSKI, B., ZHOU,
J., BONDY, C.A., BECKER, M., SCHULTZ, R.M., MISTELI,T., DE LA FUENTE,
R., KING, G.J., ADASHI, E.Y. H1FOO is coupled to the initiation of oocytic growth.
Biology of Reproduction. 72, 135-142, 2005.
WOLF, A.. Estímulo da síntese de glutationa na maturação in vitro de oócitos
bovinos e sua influência no desenvolvimento embrionário. Trabalho de dissertação.
Botucatu, 2005.
YUN Y., ZHAO G.M., WU S.J., LI W., LEI A.M. Replacement of H1 linker histone
during bovine somatic cell nuclear transfer. Theriogenology. 78, 1371-1380, 2012.
10
ZANDEMANI, M.; QUJEQ, D.; AKHONDI,M. M,; KAMALI, K.; RAYGANI, M;
LAKPOUR, N; SHIRAZ,E.S.; SADHEGI, M. R; Correlation of CMA3 Staining with Sperm
Quality and Protamine Deficiency. Lab Medicine. Vol. 43, Number 6, p. 262-267, 2012.
PARECER DO ORIENTADOR: A aluna desenvolveu suas atividades de forma
dedicada e demonstrou capacidade de aprendizado e de execução dos seus
experimentos.
DATA : ______/_________/________
_________________________________________
ASSINATURA DO ORIENTADOR
____________________________________________
ASSINATURA DO ALUNO
11
.
12