LAB8_SSCP

FFUL - Genética Humana – 2012/2013
L8
SSCP (Single-strand Conformation Polymorphism)
A técnica de SSCP permite a detecção de mutações e polimorfismos, devidas à
alteração da mobilidade de DNA em cadeia simples.
Gel de poliacrilamida 10%

Acrilamida / bisacrilamida (37,5:1)
6,25 mL

TBE 10X
2,5 mL

EDTA 0,5M pH8,0
100 µL

Glicerol
1,25 µL

Água Milli Q
15,0 mL

Persulfato amónio 10%
250 µL

TEMED
25 µL
Preparação da amostra

15 µL produto PCR + 22 µL mix EDTA/SDS/LB Bleu

Homogeneizar

Desnaturar a 95°C durante 5 min

Colocar em gelo durante 5 min

Aplicar 15 µL no gel
LB Bleu
Formamida
19 mL
Azul bromofenol
10 mg
Xileno cianol
10 mg
EDTA 0,5M pH8,0
800 µL
EDTA/SDS 10X
SDS 20%
EDTA 0,5M pH8,0
500 µL
2 mL
LB Bleu /EDTA/SDS
20 µL LB Bleu + 2 µL EDTA/SDS 10X
Electroforese

Migração a 250 V durante 1-2 horas
1
FFUL - Genética Humana – 2012/2013
Coloração com nitrato de prata (DNA Silver Staining kit – GE Healthcare)

Colocar o gel em tina e cobrir com solução de fixação 1X durante 10’. Retirar

Adicionar solução de coloração 1X e deixar 15’ em contacto ao abrigo da luz, agitando de
vez em quando. Retirar

Lavar com água Milli Q durante 1’. Retirar

Adicionar solução revelação 1X. Agitar suavemente até aparecimento das bandas

Parar a reacção por adição de solução de paragem e preservação 1X e deixar actuar
durante 15’

Colocar o gel entre folhas de papel celofane e secar no secador de géis
Solução de fixação 5X
Ácido benzeno-sulfónico 3,0% (p/v) em etanol 24% (v/v)
Solução de coloração 5X
Nitrato prata 1,0% (p/v)
Ácido benzeno-sulfónico 0,35% (p/v)
Solução de carbonato sódio 5X
Carbonato sódio 12,5% (p/v)
Formaldeído 37%
Formaldeído 37% (p/v) em água
Tiossulfato de sódio 2%
Tiossulfato sódio 2% (p/v) em água
Solução de revelação 1X
Carbonato sódio 5X
25 mL
Tiossulfato sódio 2%
125 µL
Formaldeído 37%
500 µL
Água
100 mL
Solução de paragem e preservação 5X
Ácido acético 5% (v/v)
Acetato sódio 25% (p/v)
Glicerol 50% (v/v)
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