Apresentaçao
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Terapia gênica - Princípios gerais Modificação genética das células para produzir efeito terapêutico • Ex vivo: modificação genética feita em células em cultura que são administradas ao paciente • In vivo: paciente modificação feita diretamente no Terapia gênica - Princípios gerais Necessidade de – se conhecer o gene terapêutico (clonagem do gene) – método para liberar o gene na célula alvo Métodos mais promissores: transferência gênica através de adenovirus associado e lentivirius Células alvo para introdução de genes Células humanas: hematopoéticas, fibroblastos, hepatócitos, mioblastos, etc Células xenogênicas: murinas, porcinas, bovinas, outros primatas, etc – Desvantagens: transmissão de xenoosis (algumas desconhecidas) retrovírus e Métodos para introdução do DNA alvo Virais – Retrovírus – Lentivírus – Adenovírus – Adenovírus associado – Herpes simples Transferência Gênica Retrovirus (wild-type) DNA LTR gag pol env LTR Retrovirus vector DNA LTR Packaging cell line Target DNA Genome Receptor Packaged retrovirus vector LTR Proviral RNA RT Proviral DNA Integration Product of expression cassette Genome Target cell Lentivirus (HIV-1) também codificam tat e rev genes regulatórios da expressão genes acessórios Vantagens promovem transporte ativo do complexo através do nucleoporo infectam células que não estão em duplicação Adenovirus derivados de sorotipos comuns, os quais a maioria dos adultos já foi exposta eficientes para transferência gênica não se integram no genoma (episomal) Transferência Gênica Adenovirus (wild-type) DNA E1 Expression cassette (Target DNA) Adenovirus vector DNA E3 E3 Complementing cell line Genome Episomal action Receptor Adenovirus vector Endosome Product of expression cassette Genome Target cell Adenovirus associado (AAV) Parvovírus humanos que requerem um adenovirus para mediar infecção Eficientes para transferência gênica Não há doença conhecida associada com infecção pelo AAV Podem integrar o genoma aleatoriamente ou Podem ter localização episomal Métodos para introdução do DNA alvo Não-Virais – LIpofecção – Eletroporação – Precipitação com Fosfato de cálcio – Bombardeio de partículas Transferência Gênica Plasmid with expression cassette (target DNA) Lipossomes Episomal action Fuse with plasma membrane Genome Endosome Product of expression cassette Target cell Transferência Gênica Injeção direta de DNA em células alvo – Ex: Hemofilia B - injeção IM do gene do fator IX Anemia - injeção IM do gene da eritropoetina Neoplasias - injeção no tumor : Infusão ou modificadas implante de células Gene p53 Gene suicida Anti-sense geneticamente Regulatory Review Required for Gene Transfer Trials U.S. Comitê de Ética Local Comitê Local de Biosegurança FDA Recombinant DNA Advisory Committee, NIH Brazil Comitê de Ética Local CONEP Comitê Nacional de Biosegurança Terapia gênica para hemofilia Vantagens níveis > 2% efeito terapêutico não é necessária regulação gênica refinada não é necessária expressão tecido específica rFVIII ou rFIX comerciais já existem avaliação da eficácia é fácil : níveis plamáticos Ensaios Clínicos Ex vivo : transfecção de fibroblastos autólogos com plasmideo contendo F.VIII Transplante de fibroblastos autólogo Implantar células no omentum Ex vivo pouco risco de transmissão para células germinativas Expansão clonal de uma célula risco mínimo de mutagenesis Procedimento trabalhoso Ensaios Clínicos In vivo Infusão EV de vetor retroviral expressando F.VIII Infusão EV de vetor adenoviral expressando F.VIII injeção IM de AAV/hF.IX infusão na artéria hepática de vetor AAV/ F.IX Hemofilia • Administração do vetor bem tolerada • Não houve formação de anticorpos • Detecção transitória do vetor em semem após infusão EV de retrovirus ou adenovirus em artéria hepática • Risco de transmissão para células germinativas parece baixa Hemofilia • Outros tecidos além do fígado podem secretar fatores de coagulação biologicamente ativo • F.VIII administrado por métodos virais e não virais resultou em aumento transitório deos níveis de fator VIII (até 2%) em poucos pacientes • Transferência de FIX mediada por AAV em músculo esquelético resultou em expressão duradoura de F.IX, mas em níveis subterapêuticos ( até 4%) • Transferência de FIX mediada por AAV em fígado resutou em aumento de até 11% nos níveis de F.IX. Ensaios Clínicos 41 pacientes hemofílicos submetidos à terapia gênica Desafios sustentar efeito inibir resposta imune aumentar expressão do transgene Gene da Eritropoetina para tratamento de anemia Vetor não viral injeção IM em camundongos estímulo elétrico Hematócrito antes e após terapia gênica com gene da EPO 95 Hematócrito (%) 85 EPO 75 65 55 45 35 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 O Sistema Tet-Off para controle da expressão gênica transativador PCMV TRE pCMV TRE tetR AD Gene alvo pCMV Presença de transcrição Gene alvo Ausência de transcrição Doxociclina ou tetraciclina Controle da expressão gênica pela administração de Doxociclina H em ató c rito (% ) 95 85 75 65 55 45 Doxociclina 35 1 2 3 4 5 Se m a n as 6 7 8 9 Sangue Periférico Medula Óssea + fatores de crescimento Células Progenitoras Hematopoéticas Placenta Seleção CD34+ Crescimento in vitro Transferência gênica Infusão de células genéticamente alteradas Correção de hemoglobinopatia anemia falciforme e talassemia (camundongos) Vetor: lentivirus Gene: beta-globina Transferência do gene para células CD 34+ Mieloablação e infusão das células modificadas Correção de talassemia Correção de doença falciforme * * * X-LINKED SCID: FIRST EXAMPLE OF THERAPEUTIC GENE TRANSFER Lethal disease Caused by gc cytokine receptor deficiency Curable by bone marrow transplantation Cavazzana-Calvo et al. Gene therapy of human severe imunodeficiency disease. Science :288:669, 2000 Terapia gênica para tratamento de imunodeficiência grave 2 crianças de 8 e 12 meses de idade com mutação da cadeia gama do receptor comum para citocina – colhidas células precursoras hematopoéticas (CD 34+) – introdução do gene alvo + retrovírus – reinfusão das células modificadas na corrente circulatória Resultado – expressão do receptor nas células do sangue periférico e nos linfócitos – os linfócitos passaram a funcionar – redução das infecções Terapia gênica para tratamento de deficiência de adenosina deaminase (ADA) Também causa imunodeficiência grave 3 crianças com diagnóstico pré-natal colhido sangue de cordão umbilical e separadas células precursoras (CD34+) introduzido gene da adenosina deaminase (ADA)+ retrovírus LTR c DNA Adenosina deaminase transplante autólogo Resultado: melhora das infecções LTR Detecção de vetor ADA por PCR semiquantitativo Kohn et al, 1995, Nature Medicine Retrovirus-mediated wild-type p53 gene transfer to tumors of patients with lung cancer J.A. Roth, et al Pretreatment (a and c) and 30 day posttreatment (b and d) bronchoscopic images Nature Medicine, Volume 2, Number 9, September 1996 Terapia Anti-sense DNA alvo DNA anti-sense Transcrição RNAm sense RNAm anti-sense Bloqueio da Tradução para proteína Terapia Anti-sense Atividade anti-linfoma com antisense BCL-2 (Webb et al, Ann Oncol, 7(suppl.3),32,1996) – Metodologia: 13 pacientes com linfoma que expressavam bcl-2, em recaída após vários esquemas de quimioterapia – 6 injeções parenterais do antisense – Resultados: 1 paciente com resposta completa, pacientes com resposta parcial Bcl-2 antisense oblimersen sodium (Genasense) 4 Produção de vacinas de tumor autólogo Ressecção e cultivo de células tumorais gene Imunoestimulação das células modificadas Injetar células sc Testar expressão gênica Gene Suicida Ex: HSV - TK Herpes simples Timidina Quinase Ganciclovir Fosforilação do Ganciclovir Morte celular Células xenogênicas para terapia gênica Exemplo: Linhagem murina produtora de vetor contendo o gene suicida timidina quinase + regiões do vírus herpes simples para tratamento de Tumor cerebral Objetivo: induzir a transformação de uma pró-droga em droga. O herpes simples tem afinidade pelo sistema nervoso. A timidina quinase fosforila o ganciclovir . O ganciclovir fosforilado destrói a celula Transferência de células produtoras de HSV-tk em Tumor Cerebral Ram et al, 1997 - Nature Medicine 3:1354 Ram et al, 1997 - Nature Medicine 3:1354 Segurança em Terapia Gênica Vetor adenoviral expressando gene Ornitina Carboxilase (OTC) Infusão em artéria hepática em adultos com doença leve ou heterozigotos Setembro 1999, paciente com doença leve recebeu altas doses de vetor ( 6x1011 vp/kg) Desenvolveu febre, falência de múltiplos órgãos Terapia gênica para tratamento de imunodeficiência grave Em 2002 11 pacientes em tratamento com boa resposta: melhora da imunodeficiência – 4 pacientes desenvolveram leucemia mielóide aguda (2002 , 2003, 2004) – Interrupção do protocolo Pacientes com imunodeficiência teriam menos chance de rejeitar células neoplásicas?? Toxicidade potencial da terapia gênica Relacionada ao vetor - resposta imune - integração Relacionada ao Transgene - response imune - superexpression Transmissão para células germinativas Segurança em terapia gênica Lentivirus e AAV têm maior chance de se integrar em genes ativos (exons) – Schroder et al (Cell, 2002) – Nakai et al (Nature Genetics, 2003) Conclusão Terapia gênica é uma realidade Agradecimentos • Margareth Castro Ozello • Valder R.Arruda • Marcelo Agostinho Salomão • Denise Silvia Souza • Dilmara Lopes Vicentim
