Vírus - NEBM

Vírus
Virologia
- São agentes infecciosos, não celulares.
São
parasitas intracelulares
obrigatórios
e
infectam
hospedeiros específicos
Virologistas
- Animais
- Insectos (alguns, são vectores na
transmissão a animais e humanos)
- Plantas
-
Doenças
(impacto na Saude
Pública,
na Agricultura,
Economia, etc.)
Bactérias (chamam-se bacteriófagos ou fagos)
- Fungos
- Outros microrganismos
Principais vias de transmissão
de infeccções virais aos seres
humanos.
Preocupações em Saúde
Pública:
- Vírus emergentes (HIV,
Ebola, etc,)
- Facilidade de viajar e
alteração do meio Ambiente,
podem contribuir para
espalhar “novos” virus para
novas áreas
(Maier, Pepper e Gerba,
Environmental Microbiology, Academic Presss, 2000
- Muitas epidemias de doenças virais ocorreram antes de se
ter percebido a natureza dos agentes causadores.
(Ex. colonização da América pelos europeus (sec. XVI)
P. ex. Varíola (small pox)
contribuiu para dizimar
populações nativas)
1884 – Charles Chamberland (colaborador de Pasteur; inventor da autoclave)
inventou um filtro de porcelana para bactérias –
possibilitou a 1ª descoberta de um virus.
1892 – Dimitri Ivanowski – descobriu o virus mosaico do tabaco;
Extractos de folhas infectadas, filtrados através do
filtro de Chamberland, causavam a doença de mosaico do tabaco
em plantas saudáveis.
(Tortora, Funke e Case, Microbiology – an Introduction, 6th edition)
Aspectos que distinguem os virus de organismos celulares:
•
•
•
•
Organização estrutural simples
Um único tipo de ácido nucleico, DNA ou
RNA
Incapazes de se reproduzir fora das células
vivas; usam a maquinaria biossintética da
célula hospedeira
Parasitas intracelulares obrigatórios
A Estrutura dos virus
(Prescott, Harley, Kline, Microbiology, 6th edition, 2005, McGraw-Hill)
VIRIÃO OU PARTÍCULA VIRAL – vírus completo, fora da célula hospedeira
Ex. Virus icosaédrico
Propriedades estruturais gerais
•
Nucleocápside
– Genoma viral (1 ou mais moléculas de DNA ou RNA)
envolvido por camada proteica (cápside)
•
Cápside
– Camada de proteínas que envolve o genoma viral
– Protege o genoma e medeia a transferência do virus para a
célula hospedeira
– Constituida por muitas cópias de um ou mais tipos de unidades
proteicas denominadas capsómeros (cada capsómero pode ser
constituido por 5 ou 6 subunidades - protómeros).
Capsómeros
Unidades proteicas que se auto-associam para formar a
cápside.
Tipos morfológicos da cápside
icosaédrico
helicoidal
com invólucro
complexo
(Prescott, Harley, Kline, Microbiology, 6th edition, 2005, McGraw-Hill)
Morfologia de um virus icosaédrico sem envelope (nú)
Adenovirus
(Alguns causam infecções respiratórias em humanos;
alguns causam tumores em animais)
Cápside icosaédrica
- Poliedro regular com 20 faces triangulares com lados iguais e 12 vértices
- Cada tiângulo pode conter uma ou mais unidades proteícas - capsómeros
- Cada capsómero contém 5 ou 6 proteínas
Morfologia de um virus helicoidal sem envelope (nú)
Ebola virus
Cápside helicoidal
- Com forma de tubo oco, com paredes constituídas por
um ou mais tipos de proteínas; p.ex. a cápside do vírus
mosaico do tabaco contem apenas um tipo de
subunidade proteica com 158 aminoácidos
- O material genético encontra-se em espiral dentro da cápside
e o tamanho desta depende do tamanho do ácido nucleico
Morfologia de vírus com envelope
(Ex. muitos virus de animais, alguns de plantas e
pelo menos 1 de bactérias)
- Nucleocápside (icosaédrico ou helicoidal) envolvido por
uma membrana externa (constituida por lípidos, proteínas
e hidratos de carbono)
- lípidos e hidratos de carbono têm origem na membrana
plasmática ou na membrana do núcleo da célula hospedeira;
as proteínas são específicas do vírus
- muitos possuem espigões de glicoproteínas que lhes conferem
forma de aderir à superfície das células infectadas.
(Fago T4 / E. coli - colifago)
Vírus com estrutura complexa
- Tem componentes com estrutura icosaédrica e helicoidal
- Cabeça icosaédrica contem o genoma viral
- Alguns têm caudas contrácteis, com uma estrutura em hélice
e várias fibras proteicas responsáveis pela aderência do virus
à superfície da bactéria
- Só encontrado em bacteriófagos
(p.ex. colifagos T2, T4 e T6 - infectam E. coli)
Genoma viral - natureza do ácido nucleico
. Dimensão variável mas pequena: maior genoma viral conhecido – 670 kbp
. Pode ser DNA ou RNA, em cadeia simples (ss) ou cadeia dupla (ds), linear ou circular
(maior parte dos virus têm genomas lineares); alguns virus usam ambos, DNA e RNA,
como material genómico em diferentes fases do seu ciclo de vida.
Em geral:
Vírus de animais – dsDNA, ssDNA, dsRNA, ssRNA
Vírus de plantas – ssRNA
Vírus de bactérias – dsDNA (mais usual), ssDNA, ssRNA, dsRNA
. Muitos genomas apresentam as bases azotadas características
do RNA ou do DNA; outros têm bases menos ususais
como hidroximetilcitosina em vez de citosina
Formação de mRNA e replicação dos genomas em (a) virus de DNA e (b) virus de RNA
(passos essenciais nos ciclos de vida dos virus).
(a)
(b)
Convenção (virologia): mRNA – configuração “plus(+)”; cadeia complementar – configuração “minus(-)”)
. Designação de vírus com RNA ou DNA em cadeia simples:
- “plus(+)” - virus com cadeia no sentido positivo
(a sequência de bases do RNA genómico do virus tem a mesma orientação que a do mRNA viral)
- “minus(-)” – virus com cadeia no sentido negativo
(o RNA genómico do virus é complementar do mRNA viral)
De acordo com:
Classificação e taxonomia dos vírus
- Natureza do hospedeiro
- Tipo e tamanho do ácido nucleico
- Simetria e diâmetro da cápside
- Número de capsómeros em vírus icosaédricos
- Presença ou não de envelope a envolver a nucleocápside
- Tipo e composição (lipidos, proteinas, hidratos de carbono) do envelope
(quando existente)
- Propriedades imunológicas
- Nº de genes e mapa genético
- Modo de transmissão do vírus ao hospedeiro
- Localização intracelular do vírus na célula hospedeira (após infecção)
- Forma como o vírus sai da célula (após replicação)
- Doença causada, método de transmissão,
viridae
-
família
- Etc.
Ex. Retroviridae
Herpesviridae
(ssRNA)
(dsDNA)
BACTERIÓFAGOS OU FAGOS – vírus que infectam bactérias
Famílias principais
(E. coli)
Especificidade virus-hospedeiro
Depende da especificidade da ligação do
virus a locais receptores na superfície
da célula hospedeira;
(T2, T4)
(lambda, T5)
(Pseudomonas sp)
(E. coli)
(Mycoplasma sp)
Consoante o fago e a bactéria hospedeira,
os receptores podem ser:
- LPS (lipopolissacárido)
- proteínas
- ácidos teicóicos
- flagelo
- pili
PERDA DESTES RECEPTORES
Resistência da bactéria à infecção pelo
fago
(Pseudomonas sp)
(Prescott, Harley, Kline, Microbiology, 6th edition, 2005, McGraw-Hill)
REPRODUÇÃO
DE FAGOS COM
dsDNA
Exemplo.
Fago T4
/ E. coli
Attachment of T4 bacteriophage virion to the cell wall of Escherichia coli and injection of DNA.
(a) Landing and attachment, by the long tail fibers interacting with core polysaccharide
(b) Contact of cell wall by the tail fibers (electrostatic interactions; influenced by Mg2+ e Ca2+ ions)
(c) Contraction of the tail sheath and injection of the T4 genome
CICLO LÍTICO
Fagos virulentos –
Ciclo de vida culmina na lise
da célula hospedeira, para
libertação dos viriões novos
Lise enzimática:
-Endolisina (ataca peptidoglicano)
-Holina (lesões nas membranas
celulares)
- usa RNA polimerase da célula
- Sintese de proteínas que
permitem ao fago bloquear o
metabolismo da célula
hospedeira,
Degradar DNA da
célula hospedeira e
- DNA T4 contém
hidroximetilcitosina
(HMC) em vez de citosina;
- HMC é glucosilado
Glucosilação protege DNA
do fago da acção de
endonucleases de restrição
das células infectadas
(mecanismo de defesa contra infecção viral)
produzir cópias novas
do DNA viral
- Síntese de proteínas
do capsídeo, da cauda e
outras necessárias para a
montagem do virião
(Prescott, Harley, Kline, Microbiology, 6th edition, 2005, McGraw-Hill)
. Fase latente (entre adsorção do virus e libertação dos viriões maduros): 22 min
. Libertação de cerca de 100 viriões a partir de 1 célula infectada por 1 virus (colifago T4)
Cultivo de vírus de bactérias (bacteriófagos)
- são cultivados em culturas de células bacterianas
- quantificação:
Bacteriófagos Líticos :
-- Em
Em meio
meio líquido
líquido
causam clarificação
da suspensão celular
de bactérias
-- Em
Em meio
meio sólido
sólido
levam à formação de
placas (ou halos)
de lise
“PFU – Plaque Forming Units”
(Madigan, Martinko e Parker, Brock Biology of microorganisms, 10th ed)
FAGOS TEMPERADOS E CICLO LISOGÉNICO
Ex. Fago lambda / E. coli
Excision
Indução do ciclo lítico é um
fenómeno raro e pode ser
estimulado por radiação UV,
temperaturas altas ou stresse
químico
(vantagens)
GENOMA DO FAGO λ
Repressor lambda
•
•
Produto do gene cI
Bloqueia a transcrição dos
genes do ciclo lítico,
incluindo do gene cro
Proteina Cro
•
•
Envolvida na regulação dos
genes do ciclo lítico
Bloqueia a sintese do
repressor lambda
Taxa de produção dos produtos dos genes cro e cI
determina se ocorre o ciclo lisogénico ou o lítico.
Indução está associada a redução nos níveis do repressor lambda - pode ser causada
por radiação UV ou químicos que causam danos no DNA
Consequências principais da lisogenia
1. Células lisogénicas são imunes a
reinfecção pelo mesmo fago;
2. Células hospedeiras lisogénicas
podem exibir fenótipo alterado.
Por exemplo:
- modificação da estrutura do
lipopolisacárido (LPS) de Salmonella sp.
- produção de toxinas por bactérias patogénicas
(exotoxina da difteria por Corynebacterium
diphtheriae; toxina de Staphylococcus aureus – escarlatina
toxina de Clostridium botulinum - botulismo)
3. Transdução
especializada
Transdução – transferência de material genético entre bactérias
mediada por virus
(ver também transdução generalizada em aula sobre
transferência de material genético)
Transdução especializada
Após indução, quando o profago sofre
excisão do cromossoma da célula
hospedeira, uma porção deste pode
permanecer ligado ao DNA do fago; após o
ciclo lítico, os fagos resultantes infectam
novas células bacterianas e ao incorporar o
seu DNA no cromossoma destas, podem
transportar um ou mais “novos” genes que
podem ser expressos pelas células
infectadas e conduzir a alterações
fenotípicas.
(Pelczar, Chan and Krieg, Microbiology, Concepts and Aplications, 1993)
Biotech News International, Vol. 10. Nº1, 1-2 / 2005
(www.BiotechDaily.com)
Purificação de partículas virais: por centrifugação de gradiente de densidade
1º) rotura das células infectadas suspensas em tampão adequado
2º) Centrifugação:
MISTURA DE PARTICULAS
(viriões e
macromoléculas, organelos, etc.
provenientes das células hospedeiras)
Particulas
menos
densas
Particulas
mais densas
- Gradiente de sacarose linear
- Centrifugação pode separar as
partículas com base na sua
densidade e no seu coeficiente de
sedimentação (função do tamanho
e densidade da particula – virus,
macromolecula ou estrutura biológica).
(Prescott, Harley, Kline, Microbiology, 6th edition, 2005, McGraw-Hill)
Purificação de partículas virais: por centrifugação diferencial
Sobrenadante,
com moléculas solúveis
Partículas
virais
icosaédricas
Organelos
das células hospedeiras
(Prescott, Harley, Kline, Microbiology, 6th edition, 2005, McGraw-Hill)
Purificação de partículas virais: digestão enzimática de constituintes
celulares das células hospedeiras
P.ex. Remoção de ácidos nucleicos e proteinas celulares (das células hospedeiras)
das preparações de viriões por acção de nucleases e proteases
(particulas virais completas são muito resistentes à acção desses agentes)
Principais familias
de virus que infectam
animais
(varíola)
(Hepatite B) (Herpes simplex;
varicela)
(cancro)
(constipação;
isolados de adenóides)
(raiva)
(gripe)
(Ebola; Marbourg)
(rubéola)
(poliomielite; hepatite A)
(Prescott, Harley, Kline, Microbiology, 6th edition, 2005, McGraw-Hill)
Isolamento e cultivo de virus
O cultivo de virus requer um hospedeiro vivo.
Vírus de animais:
- animal (cobaia de laboratório)
- ovo de galinha fertilizado
- Linhas celulares;
cultura de tecidos de células animais
(Prescott, Harley, Kline, Microbiology,
6th edition, 2005, McGraw-Hill)
As células infectadas podem
sofrer degenerescência,
observável por microscopia
(EFEITO CITOPÁTICO)
As células infectadas por CERTOS VIRUS também podem sofrer LISE – quando lisam forma-se
uma área, localizada, de destruição denominada placa (HALO DE LISE)
Photomicrograph of a cell culture
Cell cultures in monolayers grown on a Petri plate
and plaques due to virus-induced cell lysis
Efeitos possíveis da infecção por virus em células animais hospedeiras
(Ex. Cancro)
(Ex. hepatite A)
(Ex. sarampo; hepatite B;
papeira; rubéola, gripe)
(Ex. Herpes simplex virus;
varicela; citomegalovirus)
Virus de animais
Penetração do virus na célula hospedeira
1.
Ex. poliomaviridae
Plasma
membrane
2.
Plasma
membrane
(Prescott, Harley, Kline, Microbiology, 6th edition, 2005, McGraw-Hill)
Ex. HIV
3.
Ex. Gripe (influenza)
Endossome
citoplasm
(Prescott, Harley, Kline, Microbiology, 6th edition, 2005, McGraw-Hill)
(Tortora, Funke e Case, Microbiology – an Introduction, 6th edition)
Movimento de um vírus no citoplasma de uma célula
Libertação de um virus com invólucro (Ex. influenza)
- por gemulação da membrana citoplasmática da célula hospedeira
1º) Hemaglutidina e neuraminidase (proteínas virais) são inseridas na membrana plasmática da célula hospedeira
2º) nucleocápside liga-se à membrana e proteinas da membrana (a verde) são afastadas
3º) membrana sofre gemulação e liberta virião maduro
(Prescott, Harley, Kline, Microbiology, 6th edition, 2005, McGraw-Hill)
Neuraminidase – enzima que ajuda o virus a penetrar células do epitélio respiratório do
hospedeiro infectado
Hemaglutinina – permite ao virus aderir aos glóbulos vermelhos do sangue causando a
aglutinação destes; participa na adsorção do virus à célula hospedeira.
(Prescott, Harley, Kline, Microbiology, 6th edition, 2005, McGraw-Hill)
Diagrama simplificado do
ciclo de vida de
virus Influenza ( negative ssRNA)
. Entrada por endocitose e transferência da molécula
(-) ssRNA viral para o nucleo da célula infectada;
. Transcrição do RNA viral (passo 1)
(moléculas RNA da célula hospedeira são cortadas na
extermidade 5´ e os fragmentos resultantes
(10-13 nucleotideos) “capped” são usados como
iniciadores (“primers”) na síntese de mRNA viral (+))
mRNA viral medeia:
. Passos A - síntese da RNA Polimerase (replicase PBI,
que cataliza a replicação do RNA viral) e síntese
das proteínas da cápside (NP);
. Passos B – síntese das proteínas do envelope externo
do novo virus, HA – hemaglutinina e NA – Neuramidase,
que são inseridas na membrana citoplasmática da
célula hospedeira.
. Replicação do RNA viral (passo 2)
(A replicase viral (PBI) converte o (-)ssRNA viral numa
molécula de RNA em cadeia dupla, que é designada
forma replicativa, e a cadeia (+) desta medeia a síntese
de várias cópias de novo RNA viral (-ssRNA).
. Associação de cópias novas da cápside e do RNA viral.
(Passos C)
. Saída dos viriões maduros da célula por gemulação
A
B
C
FIG. 18.7
(Prescott, Harley, Kline, Microbiology, 6th edition, 2005, McGraw-Hill)
RETROVIRUSES
Retroviruses are RNA viruses
that replicate through a DNA intermediate.
The retrovirus called
human immuno deficiency virus (HIV)
causes AIDS.
The retrovirus virion
contains an enzyme,
reverse transcriptase,
that copies the information
from its RNA genome into DNA,
a process called reverse transcription.
Structure of a retrovirus
The retrovirus DNA can be transcribed
to yield mRNA (and new genomic RNA)
Genetic map of a typical retrovirus genome
Gag → large primary gag protein
→ core proteins (due to protease activity)
Pol → reverse transcriptase
and integrase
Env → envelope proteins
R – direct repeats (replication process)
Some retroviruses have a 4th gene envolved in
cellular transformation and cancer
ssRNA(+) → ssDNA → dsDNA → mRNA
(ssRNA +)
or may remain in a latent state.
Examples of retroviruses:
- Some exist that cause cancer
- HIV – human immunodeficiency virus
(infects a specific kind of T lymphocyte; immune system)
Processo de replicação em retrovirus:
(são virus com envelope; a partícula viral
contém enzimas: transcriptase reversa,
integrase de DNA e protease).
Passos principais:
Entrada na célula por fusão entre o envelope do virus e a
membrana plasmática da célula, em locais da memebrana
plasmática com receptores específicos;
o envelope do virus fica na membrana plasmática,
e o nucleocápside, contendo o genoma e as enzimas,
é libertado no citoplasma;
Transcrição reversa do ssRNA em dsRNA, por acção
da transcriptase reversa viral, e entrada do dsDNA resultante
no núcleo da célula hospedeira;
Integração do DNA retroviral (Provirus) no genoma da célula
hospedeira (pode permanecer nesse estado estável
indefinidamente);
Transcrição do DNA retroviral, levando à formação de
moléculas de mRNA viral e do genoma viral (ssRNA);
Montagem e encapsidação do RNA genómico
em nucleocápsides, no citoplasma;
Aquisição do envólucro na membrana plasmática e saída
do virus completo por gemulação.
R – direct repeats
LTR – Long terminal repeats
AGENTES QUIMIOTERAPÊUTICOS ANTIVIRAIS
• Genéricamente, drogas antivirais clinicamente efectivas incluem
análogos de nucleósidos e outras drogas que inibem a polimerização
de ácidos nucleicos e a replicação do genoma do virus.
Inibidores de proteases → interferência nos passos de maturação do virus
Análogos de nucleósidos → inibição do enlongamento da cadeia de
ácidos nucleicos virais
Interferão → paragem do processo de replicação viral;
são glicoproteínas de baixo peso molecular (17.000 Da)
que são produzidas pelas células animais em resposta à infecção
por certos virus; as moléculas de interferão induzem a síntese de
proteínas antivirais na célula infectada que especificamente inibem
o processo de tradução do mRNA do vírus.
(Lim, D, Microbiology, 2nd ed, 2002, WCB/McGraw-Hill)