Alongamento do Blastocisto
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DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO PRÉIMPLANTAÇÃO Disciplina: Fecundação em Mamíferos Prof. Joaquim Mansano Garcia Clara Slade Oliveira Outubro, 2006 CRONOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO EM MURINOS Wang & Dey, 2006 CRONOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO NOS ANIMAIS DOMESTICOS PARÂMETRO Desenvolvimento do Embrião (dias) 2 células ESPÉCIES Bovino Equino Ovino Suíno 1 1 1 0,6-0,8 4 células 1,5 1,5 1,3 1 8 células 3 3 1,5 2,5 7-8 6 6-7 5-6 Blastocisto Eclosão 9-11 8 7-8 6 Transporte do Embrião ao Útero Horas 72-84 140-144 66-72 46-48 Estádio celular 8-16 BL 8-16 4 Alongamento do Blastocisto (dias) 13-21 11-16 11-15 HAFEZ & HAFEZ, 2004 DESENVOLVIMENTO INICIAL: ZIGOTO A 8 CÉLULAS Clivagens: sucessivas divisões mitóticas sem crescimento celular Estoque materno de transcritos Ativação do genoma zigótico Polarização dos blastômeros CICLO CELULAR INICIAL EMBRIONÁRIO CDK2 + * condensação da cromatina; * quebra do envelope nuclear; * Formação do fuso mitótico = CICLINA B MPF = FASE M M G2 mit. 1 S I G1 S I 2 mit. M 1. Célula padrão 2. Célula embrionária inicial ATIVAÇÃO DO GENOMA ZIGÓTICO Wang & Dey, 2006 PRIMEIRA CLIVAGEM: PADRÃO PRÉ-ESTABELECIDO? (ZERNICKA-GOETZ; PLUSA) PRIMEIRA CLIVAGEM: PADRÃO PRÉ-ESTABELECIDO? (HIIRAGI E SOLTER, POR ZERNICKA-GOETZ) PRIMEIRAS CLIVAGENS: PADRÃO EM ANFÍBIOS E PEIXES – MECANISMO SIMILAR PARA MAMÍFEROS ? (DRIEVER, 2005) SEGUNDAS CLIVAGENS: CONTRIBUIÇÃO NA FORMAÇÃO DO BLASTOCISTO? (HADJANTONAKIS & PAPAIOANNOU,2004) SEGUNDAS CLIVAGENS: DIVISÕES MERIDIONAIS X EQUATORIAL (PIOTROWSKA & ZERNICKA-GOETZ, 2005) M : originadas de divisão meridional: ICM internas e TE polo embriônico A: originadas do pólo animal de divisão equatorial ou oblíqua: ICM superficiais e TE adjacente V: originadas do pólo vegetal de divisão equatorial ou oblíqua: TE mural COMPACTAÇÃO E FORMAÇÃO DA BLASTOCELE GAP junctions PAR proteínas e microtúbulos: Polarização do embrião Formação de 2 pólos e 2 tipos celulares (ICM e TE) Formação da blastocele COMPACTAÇÃO E FORMAÇÃO DA BLASTOCELE Principais eventos na compactação • E-caderina contatos celulares achatamento dos blastômeros • PAR proteínas e microtúbulos: Polarização do embrião PAR PROTEÍNAS E MICROTÚBULOS: DIVISÕES ASSIMÉTRICAS E POLARIZAÇÃO DO EMBRIÃO (VINOT et al, 2005) polarização máxima = divisões simétricas = células externas; polarização moderada = divisões assimétricas = células externas polarizadas e irmãs não polarizadas da icm; mínima polarização = posição externa. ESTABELECIMENTO DAS GAP JUNCTIONS (HOUGHTON, 2005) • Passagem de metabólitos, íons e 2o mensageiros • Regulação de Ca2+, pH e AMPc • não representa a maior forma de comunicação: transportadores específicos de membrana FORMAÇÃO DA CAVIDADE DO BLASTOCISTO: 3 MODELOS PLUSA, 2005 GARBUTT et al, 1987 MOTOSUGI & HIIRAGI, 2005 DIFERENCIAÇÃO DAS LINHAGENS CELULARES NO BLASTOCISTO: GENES ENVOLVIDOS Wang & Dey, 2006 DESENVOLVIMENTO DO BLASTOCISTO: ALONGAMENTO (VAJTA, 2004) • Sistema in vitro para cultivo de blastocistos bovinos - alongamento, rápido crescimento celular e diferenciação • Blastocistos expandiram até d16 • d12: 2a camada celular abaixo do trofoblasto, que envolveu os embriões no d14 (hipoblasto) DESENVOLVIMENTO DO BLASTOCISTO: ALONGAMENTO (VAJTA, 2004) d10 d16 (a) d12 d16 (b) d14 Signs of differentiation in elongated blastocysts: (a) inner cell mass with cell groups of different morphological appearance, (b) formation of hypoblast layer, see borders marked with arrows. Bar represents 0.2 mm. METABOLISMO EMBRIONÁRIO E CULTIVO IN VITRO Co-cultivo: Células da granulosa, tuba e cels uterinas, BRL (buffalo and rat liver).. •Produzem fatores de crescimento (GANDOLFI & MOOR,1987); •Reduzem tensão de O2 para os embriões (sistema 20% O2)(BAVISTER,1988) •Consomem nutrientes e liberam metabólitos tóxicos, promovem maior variação na composição do meio •Podem veicular patógenos METABOLISMO EMBRIONÁRIO E CULTIVO IN VITRO Fontes energéticas: Lactato, Piruvato e Aas, e Glicose (a partir da compactação) GLICOSE (glicólise aeróbica) • toxicidade em embriões, causando bloqueio no estádio de 2 células em hamster (BARNETT et al,1997) e de 8 células em bovinos (KHURANA,2000); • melhora do tamanho e número de células quando adicionado após compactação, promovendo o crescimento rápido (VAJTA,2004) LACTATO E PIRUVATO (ciclo dos 3 carbonos – TCA) • estádios iniciais e avançados; • aumento de 3 a 4x da oxidação no desenvolvimento mórulaBL, mesmo com a adição de glicose (KHURANA,2000) METABOLISMO EMBRIONÁRIO E CULTIVO IN VITRO Fontes protéicas: nutrem o embrião inicial e parecem reduzir toxicidade de metabólitos (ECKERT & NIEMMAN, 1995); acúmulo de lipídeos e maior sensibilidade à congelação (HOCHI et al,1999) • soro fetal bovino: questões sanitárias; gigantismo fetal; aumenta % blastocistos; variação na composição • Substitutos do soro: albumina sérica bovina, knockout®,PVA E PVP (macromoléculas sintéticas) METABOLISMO EMBRIONÁRIO E CULTIVO IN VITRO (YUAN, 2002) Atmosfera Gasosa: • In vivo: tuba uterina 5,3 a 8,7% O2 • 5%CO2, 20% ar: co-cultivo e SFB • 5%CO2; 90%N; 5%O2 (controlada): meios quimicamente definidos com ou sem SFB • Stress oxidativo: ROS – altera conformação e atividade celular, desenvolvimento retardado METABOLISMO EMBRIONÁRIO E CULTIVO IN VITRO (YUAN, 2002) METABOLISMO EMBRIONÁRIO E CULTIVO IN VITRO (YUAN, 2002) METABOLISMO EMBRIONÁRIO E CULTIVO IN VITRO (CRAIG,2004) Suplementação de leptina no cultivo em suínos • receptores no embrião pré-implantação • foi detectada na tuba uterina de porcas prenhas, mas não em vazias • Sinergismo quando adicionado na MIV e CIV • MAPK e proliferação celular? METABOLISMO EMBRIONÁRIO E CULTIVO IN VITRO (CRAIG,2004) METABOLISMO EMBRIONÁRIO E CULTIVO IN VITRO (SIRISATHIEN, HERNANDEZ-FONSECA, BRACKETT,2002) Suplementação de IGF1 E EGF no cultivo • IGF1: ação anti-apoptótica; efeito mitogênico e taxa de blastocisto • EGF: mais importante na diferenciação celular do que na proliferação; taxa de desenvolvimento de embriões de 4 células • Sinergismo de IGF1 e EGF NÃO FOI OBSERVADO (SIRISATHIEN, HERNANDEZ-FONSECA, BRACKETT,2002) (SIRISATHIEN, HERNANDEZ-FONSECA, BRACKETT,2002)
