UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE – FURG INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICASFISIOLOGIA ANIMAL COMPARADA Relação entre a plasticidade celular e o fenótipo de resistência a múltiplas drogas Michele Carrett Dias Garcia Tese defendida no âmbito do Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas – Fisiologia Animal Comparada, como parte dos requisitos para obtenção do título de DOUTOR em Fisiologia Animal Comparada. Oientadora: Profª. Drª. Gilma Santos Trindade Coorientadores: Profª. Drª. Ana Paula de Souza Votto Prof. Dr. Luis Fernando Marins Rio Grande, 2015 Agradecimentos Agradeço a Deus por todas as oportunidades, principalmente a de viver. Agradeço aos meus pais, Soila e Osmar, pelo apoio e por sempre acreditarem em mim. Amo muito vocês. Agradeço às minhas irmãs, Daiane e Daniele, pelo apoio, pela cobrança, por acreditarem que estudar vale à pena. Não consigo imaginar a minha vida sem vocês. Agradeço ao meu esposo, pela paciência, pelo amor, pelo mate, por acreditar em mim e por cuidar dos nossos filhotes caninos Xirú e Luna. Agradeço aos meus cunhados Rodrigo e Vagner pelo apoio, pelos momentos de descontração e por cuidarem muito bem das minhas irmãs. Agradeço aos meus afilhados João Victor, Miguel e Diego, por me ensinarem muito. É uma forma totalmente diferente de ver a vida. Peço desculpas por não estar presente da forma que gostaria. Agradeço também a todos os outros integrantes da minha família, tios, tias, madrinhas (Ju, Vó Beta e Carlinha por acreditarem em mim e que estudar vale à pena), padrinhos (Tio Ricardo, Vô Luis e Miri), primos, primas, de todos os graus por ajudarem na minha formação. A minha formação não foi baseada somente nos conhecimentos desses últimos anos, e sim desde a base, nas brincadeiras, nas descobertas, nas observações e por isso que mesmo não estando presentes, agradeço por fazerem parte da minha vida. Um agradecimento em especial a família do Tio Milton, que sempre me acolheu nesses anos de FURG como um coração de mãe, onde sempre cabe mais um. Agradeço ao meu sogro João Paulo, a sogrinha Evani, ao cunhado Mateus e à minha filha de coração Ana Luiza, família que conheci através do Tiago e que faço parte, pelo apoio e carinho. Agradeço a todos os meus amigos, os muito próximos, os próximos, os distantes e os muito distantes. Como já dizia Milton Nascimento, é para guardar no lado esquerdo do peito. No ambiente acadêmico, agardeço a todas as pessoas que fizeram parte do meu convívio desde a época da graduação. Durante todo o período, desde a graduação até ingressar na pós graduação, eu sempre tive uma vontade enorme de fazer parte de um laboratório 2 onde as pessoas pareciam felizes e orgulhosas com o que faziam: cultivavam células! Uau!!! Era tudo o que eu queria! No finalzinho da graduação, o Laboratório de Cultura Celular estava recém instalado e no mestrado eu também comecei a fazer parte dele. Eu e as outras pessoas não parecíamos e, sim, éramos muito felizes e orgulhosas com o que fazíamos. Um ambiente muito sério e agradável. Ao mesmo tempo em que repetíamos várias vezes os experimentos para ter certeza dos nossos dados e cuidávamos com tanto zelo e carinho das nossas células, repetíamos o cultivo da amizade, regávamos a alegria e cantávamos lindas canções que conduziam o nosso ambiente com mais leveza. Toda vez que caminhava pelo corredor que direciona até o laboratório, eu me sentia feliz e realizada com a escolha que fiz. Que época maravilhosa essa que vivi entre o mestrado e o doutorado e por isso agradeço aos responsáveis pelo Laboratório de Cultura Celular, por me deixarem fazer parte dessa história. Um membro importante desse laboratório e que esteve presente por todo esse período foi o Técnico Márcio, uma pessoa maravilhosa, muito querida e que acompanhou todas as angústias e êxitos dos nossos trabalhos. Não sei se saudade é o termo ideal para descrever a falta que me fará viver tudo isso. Agradeço a uma pessoa muito especial que apareceu na minha vida e deixou a sua marca registrada. A Leda Karine, minha estagiária, mas às vezes eu que era estagiária dela. Uma pessoa única (dizia que era uma lástima terem colocado a forma fora), super competente, inteligente, atenta, comprometida e transparente. Agradeço ao Juliano por acreditar no nosso trabalho e pela análise da morfologia celular. Agradeço à Dani Volcan, pela ajuda na biologia molecular desde o mestrado. Sempre prestativa, super paciente, muito querida e inteligente. Agradeço as queridonas de grande coração, Dazinha, Bia, Renatinha e Aline, pelo companheirismo, pela delicadeza, pelo olhar carinhoso e atento, pelos risos, choros, enfim, por todos os momentos de conversa, de repiques e ajuda. Vocês são demais! Agradeço a todas as dicas, conversas, descontração dos integrantes dos laboratórios da cultura e da biomol, tanto os graduandos, como os mestrandos, quanto os doutorandos e os pós-docs. 3 Agradeço à Maria, o Black, as meninas da portaria, pelo bom dia, pelo café, pelo bom humor e sempre muito dispostos a ajudar. Agradeço à minha orientadora Profª. Gilma Trindade e aos meus coorientadores Profª. Ana Paula Votto e Profº. Luis Fernando Marins, pela oportunidade e pela confiança. Um agradecimento em especial a minha amiga Gilma. Muito obrigada meu Deus por essa pessoa tão especial, incrível e principalmente humana fazer parte da minha vida. Muitas pessoas são fãs de ídolos que talvez nunca saibam da sua existência. Mas eu sou fã número um dessa pessoa maravilhosa e que não existem palavras suficientes para descrever todo o meu carinho e agradecimento. Agardeço a minha amiga Ana Paula, pelos conselhos, pelo empréstimo das orelhas, por ser teimosa (como ela mesma diz) e por ter um coração de ouro. Graças a sua teimosia em acreditar nas suas percepções de que estávamos no caminho certo (que estavam certas) nunca me deixou desistir ou pensar que estava dando tudo errado. Na verdade a novela mexicana (apelido dado ao meu doutorado) marcada por anseios, pelo atraso de reagentes e por espera de pessoal chegou ao fim de uma forma bem melhor do que eu estava imaginando. Essa minha grande amiga é tudo de bom. Agradeço à professora Vivian Rumjanek pela acolhida, pelo carinho, pela atenção, pela permissão de realizar atividades no laboratório de Imunologia Tumoral. Agradeço também ao Raphael Vidal, pelo auxílio na parte do silenciamento gênico, pela paciência, pela disposição, por responder a todas as dezenas de e-mails cheios de discussões, dúvidas e questionamentos. Agradeço a todos os integrantes do grupo religioso que participo pelo apoio, pelas orações e pelas energias positivas que emanaram principalmente no finalzinho do doutorado. Agradeço à diretora Patrícia e à coordenadora Mabel, por entenderem as minhas atividades, o apoio e a ótima acolhida que tive quando cheguei na E.M.E.F. Jeremias Fróes. Um agradecimento a todos os professores do Programa de Pós Graduação em Ciências Fisiológicas – Fisiologia Animal Comparada por todas as aulas e aprendizado. E para finalizar, agradeço novamente a Deus. Quantas pessoas tive o prazer de conhecer, de conviver, de aprender com elas. Certamente, nada acontece por acaso. 4 Sumário Agradecimentos ............................................................................................................................. 2 Abreviaturas .................................................................................................................................. 7 Resumo Geral ................................................................................................................................ 8 Introdução ................................................................................................................................... 10 Objetivos ..................................................................................................................................... 19 Artigo 1........................................................................................................................................ 20 Abstract ................................................................................................................................... 22 Introduction ............................................................................................................................. 23 Results ..................................................................................................................................... 25 Treatment with high PMA concentrations results in cytotoxicity in MDR and non-MDR cell lines ..................................................................................................................................... 25 Treatment with PMA induced megakaryocyte differentiation in the cell line K562 but not in Lucena. ................................................................................................................................ 26 PMA serves as a substrate for the efflux pump in the Lucena cell line ............................... 26 Gene expression of Oct-4, Sox-2, Nanog, Alox-5 and MDR1 in cells treated with PMA ... 26 Alox-5 and Mdr1 gene expression is inverted in K562, Lucena and FEPS cells ................ 27 Discussion ............................................................................................................................... 27 Material and Methods ............................................................................................................. 31 Cell lines and culture conditions ......................................................................................... 31 Treatment of cells with PMA ............................................................................................... 31 Cell viability assay .............................................................................................................. 31 Cytology .............................................................................................................................. 32 Rhodamine 123 extrusion .................................................................................................... 32 Gene expression .................................................................................................................. 33 Statistical analysis ............................................................................................................... 33 Acknowledgements ................................................................................................................. 34 Competing interests ................................................................................................................. 34 Author contributions ............................................................................................................... 34 Funding ................................................................................................................................... 34 References ............................................................................................................................... 35 Table 1..................................................................................................................................... 40 Figures ..................................................................................................................................... 41 Artigo 2........................................................................................................................................ 45 5 Abstract ................................................................................................................................... 47 Introduction ............................................................................................................................. 48 Results ..................................................................................................................................... 50 Basal expression of Oct4, Sox -2 and Nanog gene differs among MDR and non- MDR cell lines ..................................................................................................................................... 50 Basal expression of Oct4 protein differs from the constitutive gene expression ................. 50 Silenced Lucena cells in Oct4-pg1 pseudogene decreased the expression of Mdr1 gene. .. 50 The Oct4-pg1 pseudogene silencing reduced the Oct4 protein amount.............................. 50 Intracellular marking of Oct4 protein ................................................................................. 50 Pseudogene Oct4-pg1 can influence the ABCB1 protein expression in Lucena cell line ... 51 Silencing of Oct4 - pg1 pseudogene did not alter the sensitivity of Lucena cells to vincristine ............................................................................................................................ 51 Discussion ............................................................................................................................... 51 Material and methods .............................................................................................................. 54 Cell lines and culture conditions ......................................................................................... 54 Plasmid ................................................................................................................................ 54 POU5F1B silencing ............................................................................................................ 54 Analysis of protein expression by flow cytometry ............................................................... 55 Sensitivity cell line silenced the VCR .................................................................................. 55 Cell viability assay .............................................................................................................. 55 Immunocytochemistry assay ................................................................................................ 56 Gene expression .................................................................................................................. 56 Statistical analysis ............................................................................................................... 57 Competing interests ................................................................................................................. 57 Author contributions ............................................................................................................... 57 Funding ................................................................................................................................... 57 References ............................................................................................................................... 58 Table 1..................................................................................................................................... 62 Figures ..................................................................................................................................... 63 Discussão Geral .......................................................................................................................... 70 Bibliografia geral ........................................................................................................................ 77 6 Abreviaturas 5-LO- Araquidonato 5-lipoxigenase ABC- ATP binding cassete ABCB1- ou MDR1, codifica a Glicoproteína-P ABCC1- ou MRP1, codifica a glicoproteína MRP1 ABCG2- codifica a Glicoproteína ABCG2 ou BCRP ou MXR CT- Célula-tronco CTA- Célula-tronco adulta CTE- Célula-tronco Embrionária CTH- Célula-tronco Hematopoiética CTL- Célula-tronco Leucêmica CTT- Célula-tronco Tumoral gp-P- Glicoproteína P K562- Linhagem celular não resistente a múltiplas drogas (MDR) K562-Lucena- Linhagem celular MDR LMA- Leucemia Mielóide Aguda LMC- Leucemia Mielóide Crônica MDR- Resistência à Múltiplas Drogas Oct-4 – Fator de Transcrição - marcador de CTT, CTE e células germinativas Sox-2- Fator de Transcrição - marcador de CTT, CTE e células germinativas Nanog- Fator de Transcrição - marcador de CTT, CTE e células germinativas Ph1 – Cromossomo Philadelphia 7 Resumo Geral O câncer é uma doença que afeta um grande número de pessoas no mundo. Um dos maiores problemas encontrados é a recidiva. Nesse caso, algumas células do tumor se tornam resistentes aos quimioterápicos e sua proliferação acaba desenvolvendo novamente a doença. Ultimamente tem sido atribuído os piores prognósticos do câncer quanto maior for o envolvimento de células tronco tumorais (CTTs) no processo de Resistência a Multiplas Drogas (MDR). Dentre os diversos tipos de câncer, as leucemias tem recebido grande atenção. A Leucemia Mieloide Crônica (LMC), alvo de estudo desse trabalho, acomete mais de 4.000 pessoas por ano. Para os estudos do presente trabalho, foi utilizada uma linhagem não-MDR eritroleucemica, LMC, chamada K562 e linhagens MDR, selecionadas a partir dessa pelo seu fenótipo resistente e que receberam o nome de Lucena e FEPS. Estudos anteriores demonstraram a presença dos marcadores de células-tronco hematopoiéticas (CTH) CD34+CD38- nas linhagens K562 e Lucena. Essas células possuem a propriedade de diferenciação, sendo percursoras de todos os tipos celulares sanguíneos produzidos na medula óssea. Uma das propostas de autores, como alternativa no tratamento do câncer, é induzir a diferenciação celular. No presente trabalho, induzimos a diferenciação utilizando Phorbol-12-miristato-13acetato (PMA) nas linhagens K562 e Lucena e avaliamos a resposta dessas células a essa indução de diferenciação. O PMA é conhecido por induzir diferenciação para megacariócitos na linhagem K562. O presente trabalho corroborou com a capacidade de diferenciação dessas células; porém, a diferenciação para este tipo celular não foi observada para a linhagem Lucena, embora a presença de megacariócitos seja constitutivamente maior no pool celular dessa linhagem MDR quando comparado ao pool da linhagem K562. O PMA na linhagem Lucena não induz diferenciação para megacariócitos. Quanto à expressão gênica, alguns autores tem relacionado a diferenciação de algumas linhagens à baixa expressão do gene Alox-5. Neste trabalho, a expressão desse gene foi reduzida após o tratamento com PMA, tanto na linhagem K562 quanto na Lucena. Também os genes relacionados com a característica tronco, Oct4, Sox-2 e Nanog, foram avaliados, e foi possível observar que o tratamento reduziu apenas a expressão do gene Nanog na linhagem K562. Já o gene relacionado com o fenótipo MDR, Mdr1, teve um aumento na expressão na linhagem K562. De acordo com alguns trabalhos, o fator de transcrição Oct4 pode estar relacionado com o fenótipo MDR. Na linhagem Lucena, a redução na expressão do gene Alox-5 sugere que a 8 linhagem sofreu algum processo de diferenciação, porém os genes Oct4 e Mdr1 não foram alterados. De acordo com alguns trabalhos, o gene Oct4 possui 6 pseudogenes e embora alguns autores tenham demonstrado que pseudogenes traduzem proteínas não funcionais, outros autores afirmam o contrário. Pseudogenes tem sido encontrados em cânceres sendo que o pseudogene Oct4-pg1 tem sido apontado como capaz de traduzir uma proteína funcional. O silenciamento desse pseudogene na linhagem Lucena não alterou a expressão gênica dos fatores de transcrição Oct4, Sox-2 e Nanog, mas reduziu a expressão de Mdr1. A nível proteico, o silenciamento do pseudogene Oct4-pg1 reduziu a expressão de Oct4 e da gp-P na linhagem silenciada. Por fim, foi avaliada a expressão basal dos fatores de transcrição Oct4, Sox-2 e Nanog, bem como dos genes Mdr1 e Alox-5 nas linhagens K562, Lucena e na linhagem FEPS, também MDR. A expressão do gene Mdr1 foi menor na linhagem sensível, intermediária na linhagem Lucena e maior na linhagem FEPS. Em contrapartida, a expressão do gene Alox-5 mostrou um perfil invertido nas linhagens, com maior expressão em K562 (sensível) e menor em FEPS (MDR). Os fatores de transcrição Oct4 e Sox-2 são mais expressos nas linhagens MDR quando comparados com a linhagem não MDR, e Nanog é mais expresso em K562. Como já relatado, o PMA induziu diferenciação para megacariócitos na linhagem K562 e, considerando a redução na expressão do gene Alox-5, parece que esse tratamento também induziu algum processo de diferenciação nas linhagens Lucena. Os resultados deste estudo também mostraram que o gene Alox-5 tem uma relação invertida com a expressão do gene Mdr1. Já o pseudogene Oct4-pg1 parece regular a expressão da bomba de efluxo gp-P diretamente ou indiretamente via Oct4. 9 Introdução Câncer e Leucemia Nos últimos tempos as pesquisas têm revelado uma grande diversidade de doenças conhecidas como câncer (Li & Neaves, 2006). Quando uma célula passa a se reproduzir desobedecendo aos mecanismos normais de controle do ciclo celular e começa a invadir e colonizar outros tecidos, temos o que denominamos de câncer (Alberts et al., 2010). Alguns estudos têm demonstrado a formação do câncer como produto da divisão celular e diferenciação anormais (Lo et al., 2007; Miyata, 2007). Com algumas exceções, a identidade das células tumorais no câncer fica incerta, mas observações apontam para o envolvimento de células tronco somáticas no processo oncogênico (Lengner et al., 2008). Dentre os diversos tipos de câncer existentes, iremos destacar uma doença maligna e progressiva do órgão formador do sangue, caracterizada por proliferação e desenvolvimento de leucócitos alterados e seus precursores no sangue e medula óssea. Esse tipo de câncer é chamado de leucemia. As leucemias são classificadas de acordo com o tipo de célula sanguínea afetada (Leucemia mieloide ou Leucemia linfocítica) e de acordo com as características da doença (Leucemia aguda ou Leucemia crônica) (Pokharel, 2012). A leucemia mieloide crônica (LMC) é uma forma de leucemia na qual a medula óssea produz muitas células sanguíneas, a partir da transformação malabigna das células tronco hematopoiéticas em células tronco leucêmicas, e caracterizada pela presença do cromossomo Philadelphia (Ph1) (Seke Etet et al., 2012; Rowley, 1973). Raramente ocorre em crianças e é responsável por aproximadamente 4.400 novos casos de leucemia por ano. O cromossomo Philadelphia (Ph1) é uma translocação cromossômica envolvendo os braços 9 e 22 t(9,22)(q34;q11). Parte do proto-oncogene ABL é removido do cromossomo 9 e inserido ao gene bcr no cromossomo 22. De forma similar, parte do cromossomo 22 é removido e realocado no cromossomo 9. Essa translocação leva a criação de um cromossomo 22 mais curto que codifica uma oncoproteína p210 com uma atividade tirosina quinase aumentada que, consequentemente, leva a uma aumentada estimulação da divisão celular, comparada com uma célula com a proteína 10 ABL normal (Rowley (1973); Pokharel, 2012). Esse cromossomo é encontrado em 95% das LMC assim como em algumas leucemias linfoblásticas agudas. Linhagens celulares são muito utilizadas para estudar os mais diversos tipos de câncer. Um modelo bastante utilizado é a linhagem celular K562, derivada de células leucêmicas de uma mulher que sofria de LMC. Esta linhagem possui o cromossomo Ph1 e apresentam mieloblastos como tipo celular (Lozzio & Lozzio, 1975). Holyoake e colaboradores (1999) demonstraram em amostras de pacientes com LMC, a presença de células tronco quiescentes e primitivas que possuiam o cromossomo Ph1 e a expressão de altos níveis do marcador CD34+ e ausência de CD38, CD45RA ou CD71, além disso, essas células podem sair espontaneamente da fase G0 e entrar em um estado proliferativo. Resistência a múltiplas drogas (MDR) O fenótipo MDR, em células tumorais, é um fenômeno pelo qual tumores que inicialmente respondiam a determinados quimioterápicos, passam a adquirir resistência não apenas às drogas utilizadas no tratamento, mas também a um número de outras drogas que não apresentam uma estrutura comum as primeiras, nem mesmo possuem um mesmo alvo intracelular (Gottesman & Pastan, 1993). A primeira descrição do fenômeno MDR é datada do início da década de setenta quando foi demonstrado que linhagens leucêmicas de células de pulmão de hamster chinês, expostas a concentrações crescentes de actinomicina D, tornaram-se resistentes a esta droga e também adquiriram resistência a drogas química e farmacologicamente não relacionadas, como daunorrubicina e vinblastina, às quais as células não haviam sido previamente expostas (Biedler & Riehm, 1970). Por sua vez, Dano (1973) observou que esta resistência era dependente de adenosina trifosfato (ATP), o que indicava um mecanismo ativo para as células MDR. Membros da família de transportadores ATP binding cassete (ABC) transportam vários substratos acoplados com a hidrólise do ATP. A superfamília de transportadores ABC consiste de 49 subtipos, alguns dos quais funcionam como bombas de efluxo de drogas (Abcb1, subfamília Abcc e Abcg2) ou transportadores de esteróis (Abca1, Abca7, Abcg1, Abcg5 e Abcg8) (Ohtsuki et al., 2007). Existem vários fatores que podem levar ao fenótipo MDR, porém a superexpressão da gp-P é o mecanismo melhor estudado. Esta proteína é uma 11 glicoproteína de cerca de 170 KDa, da (família ABC), expressa na membrana celular, responsável por um mecanismo de efluxo, dependente de energia, capaz de bombear agentes quimioterápicos para fora da célula (Uchiumi et al., 1993). As drogas para as quais as células que apresentam gp-P são resistentes, possuem estruturas e mecanismos de ação bastante diversificados, mas em geral são alcalóides originados de plantas ou fungos, anfipáticos, preferencialmente solúveis em lipídeos (Gottesman & Pastan, 1993). Linhagens celulares resistentes a múltiplas drogas também são muito utilizadas nos estudos in vitro, visto que a recidiva ainda é um dos maiores obstáculos enfrentados no tratamento oncológico (Xin et al., 2013). Para induzir linhagens eritroleucêmicas resistentes, alguns pesquisadores tem estabelecido modelos in vitro que permitem um estudo experimental de células resistentes a múltiplas drogas (MDR). Rumjanek et al. (1994; 2001), utilizando vincristina em células K562, selecionou células resistentes a esta droga. A essa linhagem MDR foi dado o nome K562-Lucena 1 (Lucena) para distinguir de sua linhagem parental K562 (Maia et al., 1996 a, b, Marques-Silva, 1996, Orind et al., 1997). Continuando o estudo, Daflon-Yunes e colaboradores (2013), agora utilizando daunorrubicina em células K562, também selecionaram células resistentes, nomeando-as como FEPS. Uma linhagem celular, com fenótipo MDR, apresenta características que a define como tal: resistência a drogas não relacionadas (Kartner & Ling, 1989; Tiirikainen & Krusius, 1991), expressão da Glicoproteína P (gp-P) na superfície da membrana (Gottesman & Pastan, 1993), extrusão do corante rodamina (Neyfakh, 1988) e reversão da resistência pelos agentes reversores trifluoperazina, verapamil e ciclosporina A (Ford & Hait, 1990; Sikic, 1993). O gene Abcb1 (Mdr1), um dos responsáveis pelo fenótipo MDR, é o gene que codifica a gp-P (Sonneveld & Wiemer, 1997). Além das células neoplásicas, uma variedade de tecidos humanos não tumorais expressa diferentes níveis desta glicoproteína (Schinkel, 1997). Embora a gp-P seja a proteína melhor estudada nos processos de resistência a múltiplas drogas (Scharenberg et al., 2002), existem outras proteínas associadas ao fenótipo MDR. Entre estas se destaca a glicoproteína Abcc1 (Mrp1), a qual apresenta características sequenciais e estruturais também pertinentes à superfamília ABC de proteínas de transporte (Bradley & Ling, 1994). Zaman et al. (1994) sugeriram que, a 12 exemplo da gp-P, a Abcc1 age como uma bomba de efluxo de droga, porém com algumas características singulares. Estudos de transporte in vitro indicam que a Abcc1 humana é capaz de transportar substratos conjugados ao tripeptídeo glutationa (GSH) através da catálise da proteína glutationa-S-transferase (GST) (Muller et al., 1994). Esta proteína também é encontrada em vários tecidos normais (Flens et al., 1996). Em razão da identificação crescente de novas proteínas transportadoras, a superfamília ABC de transportadores ativos foi ampliada com estudos envolvendo a proteína Abcg2. Esta é uma proteína igualmente associada ao fenótipo MDR (Scharenberg et al., 2002). Estes autores demonstraram, através de experimentos de transfecção, que a expressão de Abcg2 é necessária e suficiente para gerar o fenótipo MDR em células renais de embrião humano. Os transportadores de drogas da família ABC tem mostrado proteger células tronco tumorais de agentes quimioterapêuticos. Os genes Abcb1, Abcg2 e Abcc1 são os principais genes de resistência a múltiplas drogas, identificados em células tumorais (Kim et al., 2002; Scharemberg et al., 2002). Uma propriedade particular das células tronco (CT) é a expressão de altos níveis de transportadores ABC específicos (Dean et al., 2005). Célula-tronco Existem três tipos de célula-tronco: célula-tronco embrionária (CTE), derivadas das cinco ou seis primeiras divisões do zigoto e precursora de todas as células do organismo adulto; célula-tronco germinativa (CTG), aquelas que produzem oócitos e espermatozoides, responsáveis pela reprodução e célula-tronco adultas (CTA), somática ou progenitora, são consideradas mais limitadas no seu potencial e que produzem células que se diferenciam em células funcionais maduras responsáveis pela renovação do tecido normal (Sell, 2004). As CTs tem duas propriedades únicas que as tornam prováveis precursoras no desenvolvimento do câncer. Primeiro, muitas vezes elas são as únicas células que tem a capacidade de se replicar em um determinado tecido. Segundo, através de um processo chamado de auto-renovação, as CT geram novas CT com capacidades de diferenciação e de proliferação semelhantes às suas células parentais (Clarke, 2004). O fato de possuírem essas características e uma vida longa pode levar à acumulação de mais mutações ao longo das divissões. Além disso, o fato de também existir CT fora do 13 sistema hematopoiético, levanta a possibilidade de que células tronco cancerígenas podem surgir de outros tecidos e iniciar outros tipos de câncer (Beachy et al., 2004). As células-tronco específicas de um tecido eram consideradas como capazes de se diferenciar somente em células do tecido de origem, entretanto, estudos recentes mostraram que estas células podem se diferenciar em outras linhagens, quebrando paradigmas e sendo definido como plasticidade celular (Jiang et al., 2002; Herzog et al., 2003). As células-tronco tumorais (CTTs) possuem muitas propriedades semelhantes às das células tronco normais, entre elas: a vida longa tais com relativa quiescência, resistência a drogas e toxinas através da expressão de diversos transportadores ATPbinding cassete (ABC), capacidade de reparo de DNA ativa e resistência a apoptose (Dean et al., 2005). Há bastante tempo a biologia do câncer, desde o seu aparecimento até o crescimento, tem sido relacionada com a presença de CTT que mesmo constituindo uma pequena população dentro do tumor, é crítica para sua propagação (Beachy et al., 2004). Alguns grupos de células, chamados células iniciadoras de tumores, tem sido identificados no câncer e apresentam a mesma capacidade de auto-renovação, o potencial de se transformar em qualquer célula na população do tumor em geral e a capacidade proliferativa para impulsionar a expansão continuada da população de células malignas. Essas propriedades são intimamente paralelas às que definem CT normais. Células malignas com estas propriedades funcionais foram chamadas de "células-tronco tumorais". Um pequeno grupo de CTT são essenciais para o crescimento do tumor podendo compor um pequeno reservatório de células resistentes a drogas, responsáveis por sua recidiva ou pela origem de metástases (Jordan et al., 2006). O conceito de “Célula-tronco Tumoral” foi firmemente estabelecido em experimentos utilizando células de Leucemia Mielóide Aguda (LMA). Nestes estudos, uma pequena proporção de células indiferenciadas foi capaz de reconstituir o tumor in vivo. Além da potente iniciação tumoral, essas células também apresentaram capacidade de auto-renovação e de diferenciação (Bonnet & Dick, 1997). Desde então, CTTs têm sido encontradas em câncer do sistema sanguíneo, pâncreas, pele, mama e outros (Jordan et al., 2006; Li et al., 2007). A maioria das células tronco tumorais são resistentes a drogas e expressam marcadores típicos de células tronco (Zou, 2007). 14 Além disso, CTTs assemelham-se muito às Células Tronco Hematopoiéticas (CTH) com relação aos marcadores de superfície celular, multipotencialidade e novamente, pela propriedade de auto-renovação. A auto-renovação é uma propriedade essencial de algumas células tumorais e os genes que regulam este processo em uma CT normal também o fazem nas CTTs (Clarke, 2004). Do ponto de vista clínico, células tronco leucêmicas (CTL) são de interesse fundamental, uma vez que, elas são resistentes à maior parte dos tratamentos atuais, como a irradiação e quimioterapia e provavelmente também sejam contra terapias alvo como inibidores da tirosina quinase e imunoterapia (Reither et al., 2015). Como já dito anteriormente, uma propriedade presente nas células tronco é que elas expressam altos níveis de transportadores de drogas ABC específicos. Por exemplo, altos níveis de ABCG2 são encontrados em células tronco hematopoiéticas; porém, isso não ocorre em células sanguíneas maduras (Dean et al., 2005). Células Tronco e Fatores de Transcrição Para a auto-renovação, proliferação e diferenciação de CT e CTTs a ativação de determinados genes é necessária. Dentre os vários marcadores associados à pluripotência em células tronco, os fatores de transcrição Oct4, Nanog e Sox2 são indispensáveis para a divisão de células tronco indiferenciadas, sem efeito sobre o potencial de diferenciação e sem afetar sua capacidade de auto-renovação (Atari et al., 2011). Oct-4, também conhecido como Oct-3 ou POU5f1, apresenta um domínio POU com habilidade para ligar a uma sequência octamêrica (ATGCAAAT) (Scholer et al., 1989). É um regulador crítico de pluripotencialidade em embriões de mamíferos e em células germinativas primordiais (Pesce et al., 1998). Além disso, Oct-4 é um gene marcador específico para pluripotência. (Deyev & Polanovsky, 2004). A família de fatores de transcrição Sox apresenta-se como um dos reguladores mais importantes dos processos de desenvolvimento. Isto inclui, pelo menos, 30 membros diferentes, os quais são classificados em 10 subfamílias. A família Sox está intimamente relacionada a proteinas do fator celular T, o qual também contem um domínio HMG de ligação ao DNA (Schönitzer et al., 2014). O Sex-determining region Y-box 2 (Sox2) é um membro desta superfamília. Oct4 e Sox2 se ligam ao DNA cooperativamente. 15 Reconhecidamente, o caminho celular é definido por fatores de transcrição que agem ativando ou reprimindo a expressão de genes. O fator de transcrição Oct4, relacionado com a pluripotência das células tronco, controla essa característica de uma maneira quantitativa. Níveis precisos de Oct4 direcionam as células tronco embrionárias para três destinos distintos: a repressão de Oct4 induz perda da pluripotência e diferenciação para trofectoderma; alta expressão causa diferenciação para endoderma e mesoderma; um nível específico de OCT4 pode manter as células tronco em um estado pluripotente. Considerando esses resultados, o Oct4 é considerado o maior regulador da pluripotência (Niwa et al., 2000). O gene humano Oct4 pode codificar três isoformas, designadas como Oct4A (também chamado de Oct4), Oct4B e Oct4B1 (Atlasi et al., 2008; Lee et al., 2006). A localização de cada isoforma difere dentro da célula. O Oct4A encontra-se localizado dentro do núcleo das CTE; Oct4B é principalmente localizado no citoplasma de linhagens celulares de câncer somático (Lee et al., 2006; Cauffman et al., 2006) e Oct4B1 é muito expresso em célula pluripotente humana e não pluripotente (Papamichos et al., 2009). Utilizando-se o auxilio da bioinformática, tem ainda sido proposta a existência de seis pseudogenes Oct4 (Pain et a., 2005). Pseudogenes são considerados como genes não funcionais ou fragmentos de genes incapazes de traduzir uma proteína funcional (Hirotsune et al., 2003; Suo et al., 2005). Os pseudogenes Oct4 identificados são chamados de Oct4-pg1, Oct4-pg2, Oct4-pg3, Oct4-pg4, Oct4-pg5, e Oct4-pg6 (Pain et al., 2005). Mesmo sendo consideradas não funcionais pela maioria, alguns autores têm relatado funções relacionadas às proteínas destes pseudogenes. De acordo com Suo et al. (2005) os pseudogenes Oct4-pg1 e Oct4-pg5 são transcritos em câncer mas não em células de carcinoma embrionário, fibroblastos e em tecidos normais de pele e músculo. Esses autores ainda relacionam a transcrição desses pseudogenes em cânceres com a regulação da atividade do gene Oct4. Precursores de leucemia mieloide aguda CD34+CD38- tem reduzida sensibilidade à daunorrubicina in vitro e aumentada expressão de genes relacionados com a resistência a múltiplas drogas (mrp/irp) (Costello et al., 2000). Marques e colaboradores (2010) também encontraram marcadores de célula-tronco hematopoiética 16 nas linhagens de leucemia mieloide crônica, K562 e Lucena, com maior expressão de Oct4 na linhagem Lucena. Além do fator de transcrição Oct-4, o fator Nanog também tem sido relatado como um gene chave para a manutenção da pluripotência, como mostra a capacidade de diferenciação multi-linhagem e a auto-renovação perpetua das células que expressam esse gene (Mitsui et al., 2003; Oh et al., 2005). Chambers et al., (2003) mostraram que Nanog tem uma capacidade de manter um estado indiferenciado e também pluripotente em CTE. Além dos fatores relacionados com a característica de pluripotência, outros genes também parecem estar relacionados com a diferenciação de células leucêmicas e são sugeridos como alvos para o tratamento de LMC (Seke Etet et al., 2012). O araquidonato 5-lipoxigenase (5-LO), codificado pelo gene Alox-5, cataliza os dois primeiros passos da biossíntese de leucotrienos a partir do ácido araquidônico (Wang et al., 2011). Leucotrienos são mediadores de respostas inflamatórias, que podem ser formados em granulócitos, monócitos/macrófagos e outras células depois da estimulação (Steinhilber et al., 1993). O gene Alox-5 é considerado chave para a regulação da função de células tronco leucêmicas, mas não em CTH normais de camundongos, assim este gene é marcador da própria célula tumoral. Alox5 é super-regulado por BCR-ABL. A deficiência ou inibição desse gene previne o início da LMC induzida por BCR-ABL, por afetar a diferenciação, divisão celular e sobrevivência das células tronco leucêmicas, resultando em uma inibição específica de célula-tronco leucêmica (Chen et al., 2009). Esta função do gene Alox-5 parece ser específica para algumas leucemias, visto que células HL60 indiferenciadas, linhagem celular de leucemia promielocítica, não expressam o gene Alox-5. Após a diferenciação dessas células, a transcrição é aumentada (Ponton et al., 1996). Por outro lado, a enzima Alox-5 foi inibida em células de gliomas do tipo stem-like quando tratadas com o composto sintético Nordy, inibindo a auto-renovação e induzindo a diferenciação (Wang et al., 2011). Durante a diferenciação celular de algumas células tronco tumorais a expressão de genes relacionados com a resistência celular parece ser alterada. Por exemplo, o trabalho de Ohtsuki e colaboradores (2007) mostrou que vários transportadores do tipo Abca5 foram encontrados em diversos tumores e tecidos. Também detectaram a presença de Abcb1 e Abca5 em células de adenocarcinoma de colo pouco diferenciadas, 17 mas não Abcc1. Por outro lado, em células diferenciadas de adenocarcinoma de colo não foi verificada a presença de mRNA de Abcb1 ou Abca5 e sim de Abcc1 e Abca2, sugerindo que a indução de Abca5 junto com Abcb1 parece estar correlacionadas com o estado de diferenciação em tumores de colo humano. A presença de Abcb1, Abcg2 e CD133 é considerada, por alguns autores, como um marcador de célula-tronco tumoral. Em câncer gástrico, a expressão desses genes foi correlacionada com o grau de diferenciação. Em células de adenocarcinoma gástrico humano pouco diferenciadas e na linhagem celular de câncer gástrico indiferenciada, a presença de Abcb1, Abcg2 foi maior que em adenocarcionoma diferenciados e em linhagens celulares de câncer gástrico (Jiang et al., 2012). A expressão aumentada de Abcb1 e Abcg2 parece ser essencial para a proliferação in vivo e a auto-renovação em células tronco neurais, célula-tronco hematopoiética e célula-tronco pancreática. A diminuição da expressão de Abcb1 ou Abcg2 é observada com a diferenciação em CTH e em célula-tronco neural, enquanto que o aumento da expressão pode levar a um aumento na proliferação de células tronco neurais (Lin et al., 2006). A partir das reflexões acima citadas, aliadas ao conceito de plasticidade celular como um processo gênico envolvido, entre outros mecanismos, na diferenciação celular, duas perguntas nortearam o presente estudo: As linhagens leucêmicas K562, Lucena e FEPS possuem processos de diferenciação semelhantes? Determinados marcadores de células tronco exercem influência na aquisição do fenótipo de resistência a múltiplas drogas em células de LMC? A resposta destas questões resultaram em dois artigos: “Cell differentiation and the multiple drugs resistance phenotype in human erythroleukemic cells” e “Influence of Oct4 pseudogene on MDR phenotype of erytroleukemic cells”. 18 Objetivos Objetivo Geral: O objetivo deste trabalho foi comparar a resposta de linhagens celulares eritroleucêmicas, com ou sem o fenótipo de resistência celular a múltiplas drogas, à diferenciação induzida com PMA e avaliar a relação do pseudogene Oct4-pg1 com a resistência celular. Objetivos específicos: - Analisar a presença de megacariócitos nas linhagens K562 (não MDR) e Lucena (MDR) de forma constitutiva e após tratamento com PMA (agente indutor de diferenciação); -Avaliar a expressão dos genes Oct4, Sox-2 e Nanog, fatores de transcrição responsáveis pela característica de pluripotência em células tronco, após tratamento com PMA nas linhagens K562 (não MDR) e Lucena (MDR); -Avaliar a expressão do gene Mdr1, que codifica a glicoproteína P, nas linhagens K562 (não MDR) e Lucena (MDR) após tratamento com PMA; -Avaliar a expressão do gene Alox-5, relacionado com a diferenciação de células leucêmicas, nas linhagens K562 (não MDR) e Lucena (MDR) após tratamento com PMA; -Relacionar a expressão basal dos genes Alox-5, Mdr1, Oct4, Sox2 e Nanog entre linhagens K562 (não MDR), Lucena (MDR) e FEPS (MDR); - Avaliar a expressão dos genes Mdr1, Oct4, Sox-2 e Nanog, como também o pseudogene Oct4-pg1 na linhagem Lucena silenciada para o pseudogene Oct4-pg1; - Avaliar a expressão protéica de Oct4 e Mdr-1 na linhagem Lucena silenciada para o pseudogene Oct4-pg1; - Avaliar a sensibilidade da linhagem Lucena silenciada para o pseudogene Oct4-pg1 à vincristina. 19 Artigo 1 Cell differentiation and the multiple drug resistance phenotype in human erythroleukemic cells. (Artigo a ser submetido à Journal of Cell Science) 20 Cell differentiation and the multiple drug resistance phenotype in human erythroleukemic cells. Michele Carrett-Dias a, Leda Karine Almeidaa, Juliano Lacava Pereirac, Daniela Volcan Almeida b, Luis Fernando Marins b, Ana Paula de Souza Votto a*, Gilma Santos Trindade a a Laboratório de Cultura Celular, Universidade Federal do Rio Grande - FURG, Rio Grande, RS, Brazil. b Laboratório de Biologia Molecular, FURG, Rio Grande, RS, Brazil. c. Laboratório de Patologia, Faculdade de Medicina (FaMed), FURG, Rio Grande, RS. * Corresponding author: Votto, A. P. S. Universidade Federal do Rio Grande - FURG, Instituto de Ciências Biológicas, Av. Itália, Km 8, 96201-900, Rio Grande, RS, Brazil. E-mail: [email protected] 21 Abstract The gene expression of Oct-4, a transcription factor and hematopoietic stem cell marker, is higher in Lucena lines, which is MDR, and the gene Alox-5 has also been implicated in the differentiation of some cell lines. The aim of this study was to compare the response to PMA-induced differentiation in MDR and non-MDR cells. We observed the differentiation to megakaryocytes in the K562 cell line, which is nonMDR. The expression of Alox-5 and Nanog genes was downregulated and that of Mdr-1 was upregulated in K562 cells. The Lucena cell line contained a higher number of megakaryocytes than the non-MDR, but this number was not altered by PMA, as well as Mdr-1 gene expression. However, Alox-5 expression was downregulated. Alox-5 and Mdr-1 basal expression was also evaluated in the K562, Lucena and FEPS cell lines (also MDR). The expression of Alox-5 was higher in the non-MDR cell line, while FEPS had the lowest expression of this gene. The opposite pattern was observed for Mdr-1 gene expression. These results suggest that the Alox-5 gene might play a role in the differentiation of these cell lines. Keywords: Leukemia, MDR, Alox-5, Differentiation, Tumoral stem cell 22 Introduction Many studies have attempted to determine the relation between the cellular processes involved in cancer and the presence of tumoral stem cells. This study was designed to continue these efforts by examining parental erythroleukemic cells with the characteristic of multiple drug resistance (MDR) as an experimental biological model, focusing on the presence of stem cells and differentiation process. The parental cell line K562 was derived from erythroleukemic cells obtained from a woman diagnosed with chronic myeloid leukemia (CML). These cells contain the Philadelphia chromosome (Ph1) (reciprocal translocation of chromosomes 9 and 22, t(9,22)(q34;q11)), which generates the Bcr–Abl fusion gene encoding a constitutively active tyrosine kinase (Seke Etet et al., 2012). This cell line present mieloblasts as cellular type (Lozzio and Lozzio, 1975) and it is one of the most studied cell lines used in leukemia research. To induce a resistant erythroleukemic cell line, Rumjanek et al. (1994; 2001) established a model in vitro using the cell line K562, selecting for resistance with the chemotherapeutic vincristine (Tsuruo et al., 1983), thus developing a comparative experimental model for multiple drug resistant cells. The name given to the MDR cell line was K562-Lucena1 (Lucena), to avoid confusion with the parental cell line K562. Recently, the same group produce another cell line derived from K562 using the chemotherapeutic daunorubicin. The new MDR cell line, named FEPS, has different characteristics from Lucena, such as lower expression of the cellular death receptor CD95, higher expression of P glycoprotein (P-gp) and the presence of another protein related to the MDR phenotype, ABCC1 (Daflon-Yunes et al., 2013). Many factors can lead to the MDR phenotype, but the superexpression of P-gp is the most studied mechanism. The gene MDR1 (or ABCB1) encodes P-gp (Sonneveld and Wiemer, 1997). P-gp is a glycoprotein with a molecular mass of almost 170 KDa. It is a member of the ATPase family (superfamily ABC – ATP biding cassette) expressed in the cell membrane, where it functions as an energy-dependent efflux mechanism to pump chemotherapeutic agents out of the cell (Uchiumi et al., 1993). In addition to neoplastic cells, a variety of non-tumoral human tissues express different levels of this glycoprotein (Schinkel, 1997). The MDR phenotype induced by different drugs can involve the superexpression of different genes, but among these, the most commonly 23 involved are ABCB1, ABCG2 and ABCC1, already identified in tumoral cells (Kim et al., 2002; Scharemberg et al., 2002). Marques et al. (2010) identified hematopoietic stem cells (HSCs) in the leukemic cell lines K562 and Lucena due the presence of the phenotype CD34+CD38(hematopoietic stem cells markers). These authors also have shown that the promoter region of the ABCB1, ABCG2 and ABCC1 genes contains binding sites for the transcription factor Oct-4, which is also a tumoral stem cell (TSC) marker. The cell line Lucena has a higher expression of the gene Oct-4, indicating that this cell line probably presents more aggressive and invasive characteristics compared to its parental cell line K562. The concept of the “tumoral stem cell” was coined during experiments using Acute Myeloid Leukemia (AML) cells. In these studies, a small proportion of undifferentiated cells were able to reconstruct the tumor in vivo. In addition to the potent tumoral initiation, these cells also contain an auto-renewal and differentiation capacity (Bonnet and Dick, 1997). Additionally, TSCs are very similar to hematopoietic stem cells in terms of cell surface markers, multipotentiality and, as already mentioned, auto-renewal ability. Some authors consider that auto-renewal is an essential characteristic of some tumoral cells, and the genes responsible for regulating this process in a normal stem cell (SC) are the same in TSCs (Clarke, 2004). From the clinical point of view, leukemic stem cells (LSCs) are of fundamental importance once they are resistant to most of the current treatments for cancer, such as irradiation and chemotherapy, and probably also resistant to targeted therapies, such as tyrosine kinase inhibitors and immunotherapy (Reither et al., 2015). The state of the embryonic pluripotent stem cell is associated with specific transcriptional factors such as Oct-4, Sox-2 and Nanog (Chambers and Tomlinson, 2009). These factors are essential for the cell division of undefined stem cells, with no known effect on differentiation potential or auto-renewal capacity (Atari et al., 2011). Alterations in the expression of these genes can define the differentiation, dedifferentiation or autorenewal of embryonic stem cells (Chambers et al., 2003; Karwacki-Neisius, et al., 2013; Niwa et al., 2000; Rodda et al., 2005). Other genes also are involved in the differentiation of leukemic cells. The gene encoding for arachidonate 5-lipoxygenase (5-LO) (ALOX-5) has a key role in the regulation of leukemic stem cell functions, but not in normal hematopoietic stem cells 24 from mice, which makes this gene a marker of its own tumoral cell. Additionally, Alox5 is upregulated by BCR-ABL, and a deficiency or inhibition of this gene prevents the start of CML induced by BCR-ABL by affecting differentiation, cell division and leukemic stem cell survival (Chen et al., 2009). The enzyme Alox-5 was inhibited in glioma stem-like cells treated with the synthetic compound Nordy, causing an inhibition of auto-renewal and inducing differentiation (Wang et al., 2011). Biologically, Alox-5 acts mainly as a rate-limiting enzyme in leukotriene synthesis during the metabolic processing of arachidonic acid (Wang et al., 2011). Considering the continual seeking for improved treatment, or even the cure, of cellular disorders such as cancer, cell differentiation has been recognized as an alternative therapy. In advanced stages, CML presents alterations that restrict differentiation (Melo and Barnes, 2007). Therefore, the aim of the present study was to compare the response to phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-induced differentiation of MDR and non-MDR cells. Results Treatment with high PMA concentrations results in cytotoxicity in MDR and non-MDR cell lines The cell viability of the K562 line is presented in Fig. 1A,B, and for the Lucena line in Fig. 1C,D. Treatment with PMA at 0.1 and 1 nM did not affect the viability of either cell line. In the non-MDR K562 cell line, cytotoxicity was observed at the higher PMA concentrations (10, 100 and 1000 nM) since the 24 h of treatment. Cytotoxicity was observed at the two higher concentrations in the MDR cell line Lucena since 48 h. On the other hand, PMA at 10 nM inhibited Lucena cell line proliferation with no loss of cell viability. These results sugest that PMA interfere either in cell viability and in cellular proliferation. Based on these results, PMA at 10 nM was chosen for most of the remaining experiments because it was the lowest concentration affecting both cell lines. 25 Treatment with PMA induced megakaryocyte differentiation in the cell line K562 but not in Lucena. The presence of megakaryocytes was determined by cellular morphology (Fig. 2). PMA at 1 nM did not alter the number of megakaryocytes in the cell lines K562 and Lucena (Fig. 2E). On the other hand, PMA at 10 nM increased the number of megakaryocytes in the cell line K562 (Fig. 2A,B) compared to cells from the control group (Fig. 2E). In the Lucena cell line, although also present in control cells (Fig. 2E), an increase in the number of megakaryocytes after treatment with PMA was not observed (Fig. 2C,D). The frequency of megakaryocytes in the Lucena cell line was higher than in the parental cell line (Fig. 2E). When verapamil was used as an inhibitor of the efflux pump ABCB1, an increase in megakaryocytes in the Lucena cell line treated with PMA was also not observed (Fig. 3A). PMA serves as a substrate for the efflux pump in the Lucena cell line The activity of ABCB1 was evaluated in the Lucena cell line by using Rhodamine 123. Lucena cells exposed to the dye were able to extrude it, exhibiting a fluorescence value similar to cells not exposed to Rhodamine 123. The fluorescence of cells treated with PMA and receiving Rhodamine 123 was not different from those receiving only the dye or PMA (Fig. 3B). The K562 cells treated with Rhodamine 123 were more fluorescent compared to their respective control. The viability of Lucena cells treated with verapamil and/or vincristine and/or PMA at 10 nM was also evaluated (Fig. 3C). Verapamil was used to inhibit ABCB1 activity. Upon inhibition, the Lucena cell line was exposed to vincristine. Once vincristine was used in the maintenance of MDR in this cell line, treatment with this chemotherapeutic alone had no effect. Cytotoxicity was observed at 72 h in treatments with PMA at 10 nM or the combination of verapamil and vincristine. The treatment with PMA and vincristine also caused cytotoxicity at 72 h of treatment. However, the combination of verapamil and PMA caused cytotoxicity since 48 h of treatment. Gene expression of Oct-4, Sox-2, Nanog, Alox-5 and MDR1 in cells treated with PMA The gene expression of Oct-4 and Sox-2, which play a role in the characteristics of stem cells like of K562 cell line (Fig. 4A), was not altered during the treatment with PMA 10 nM. However, incubation with PMA for 24 h significantly reduced the 26 expression of Nanog. The treatment also reduced Alox-5 gene expression and induced a higher expression of Mdr1 gene (which encodes for ABCB1). On the other hand, in the Lucena cell line, incubation with PMA significantly reduced only Alox-5 gene expression, and did not alter the gene expression of Nanog, Oct-4 and Sox-2 (Fig. 4B). Alox-5 and Mdr1 gene expression is inverted in K562, Lucena and FEPS cells The gene expression of Alox-5 and Mdr1 in the cell lines K562, Lucena and FEPS without treatment with PMA is shown in Fig. 4C. The expression of Alox-5 is significantly different among the cell lines. K562 shown the higher expression and FEPS the lower. For Mdr1 the expression profile was reversed, K562 shown the lower expression and FEPS the higher gene expression. The Lucena cell line presented an intermediate expression compared to K562 and FEPS. Discussion This study analyzed the relation between cell differentiation and the phenotype of resistance to multiple drugs in erythroleukemic cells, intending to advance the state of knowledge in the cancer field by seeking a better understanding of these processes. Without doubt, the phenotype MDR is one of the main causes of failure in the treatment of cancer, and within the pursuit of treatment for this cellular disorder, promoting cell differentiation has been considered as an alternative therapy (Melo and Barnes, 2007). Based on studies showing that treatment with PMA induces megakaryocytic differentiation in the K562 cell line (Herrera et al., 1998; Hirose et al., 2013; Huo et al., 2006; Murray et al., 1993), this substance was used in this study. The choice of PMA concentrations (Fig. 1) was determined based on a curve. In the referenced studies, the PMA concentrations varied. We found that 10 nM of PMA was cytotoxic for the nonMDR cell line K562, while for Lucena this concentration only inhibited its cell proliferation. Chen and co-workers (2011) reported the inhibition of proliferation in K562 cells treated with PMA at 80 nM and related this inhibition to the increase in apoptosis. The treatment of these cells with PMA also resulted in a loss of cell growth; polyploidy; morphological changes; and an increase in cell-to-cell and cell-to-substrate adhesion (Butler et al., 1990; Colamonici et al., 1985; Fukuda 1981; Hocevar et al., 1992; Long et al, 1990; Tetteroo et al., 1984). In this study, 10 nM of PMA induced the 27 differentiation of K562 cells into megakaryocytes, although in the MDR cell line Lucena, differentiation into megakaryocytes was not observed, allowing us to consider a variety of factors. According to Hirose et al. (2013), the intracellular accumulation of reactive oxygen species is involved in the megakaryocyte differentiation induced by PMA in leukemic K562 cells. Trindade et al. (1999) and Votto et al. (2007; 2010) have shown that Lucena cells have a higher activity of antioxidant enzymes than the K562 cell line, suggesting a lower intracellular accumulation of reactive oxygen species in the MDR cell line, which could be responsible for inhibiting the induction of differentiation in this type of cell. Another factor that could explain this result could be the activity of the efflux pump in the MDR cell line, which could be extruding PMA from these cells. Lucena cells express the ABCB1 gene, which encodes the protein P-gp, at levels nearly 1400 times higher than the parental K562 cell line (Marques et al., 2010). It was possible to determine in this study that the protein P-gp was not inhibited by PMA treatment because it was unable to increase the fluorescence of cells treated with Rhodamine 123 (Fig. 3B). However, when associated with vincristine, it caused similar toxicity to that observed in the treatment solely with PMA or vincristine combined with verapamil. However, the combination of PMA and verapamil was cytotoxic at 48 h of treatment (Fig. 3C). Therefore, PMA might be a substrate for this efflux pump. However, when P-gp was blocked with verapamil, no significant increase in megakaryocytes was observed in the Lucena cell line when treated with PMA. In this case, verapamil could be blocking the differentiation process, perhaps by blocking the calcium channels (Fleckenstein, 1983). Calcium is required in the protein kinase C (PKC) signaling cascade, which participates in the differentiation process (Murray et al., 1993). Those authors have shown that PMA-induced differentiation into megakaryocytes in K562 cells involves the activation of a specific isoform of PKC, which requires the activity of the signaling complex MEK/ERK to regulate the blockage of the cell cycle, leading to the expression of cell surface markers associated with this differentiation (Herrera et al., 1998). The activation of PKC by PMA simulates the action of diacylglycerol, which is produced from inositol phospholipids initiated by the ligation of many growth factors and ligands from its cellular receptors (Nishizuka, 1992). However, according to Fleckenstein (1983), verapamil blocks the L-type voltage-gated calcium channels, and 28 the calcium used in PKC signaling might originate from the endoplasmic reticulum through the fixation of inositol triphosphate (IP3) to the IP3 activated calcium channel, when the signaling pathway of the phospholipid inositol is activated (Alberts et al., 1997). The results of Fig. 3A colaborate with this information, therefore eliminating the influence of verapamil in this study. Another possibility is that PMA does not induce the differentiation into megakaryocytes in the Lucena cell line, but rather induces its differentiation into another cell type, such as erythrocytes, for example. Indeed, during the normal differentiation process of myeloblasts (remembering that this is the cell type of the studied cell line), the progenitor of this cell line is common to the erythroid and megakaryocytic lineages. This type of progenitor cell was identified in the cell lines K562 and Lucena because both present hematopoietic stem cell markers (phenotype CD34+CD38-) (Marques et al., 2010). Concerning the transcription factors, the expression of Oct-4, Sox-2 and Nanog confirms the presence of stem cell populations in the K562 and Lucena cell lines. Decrese of Nanog and Alox-5 gene expression was observed in the K562 cells treated with PMA. This observation may explain the cell differentiation. Nanog is downregulated during the differentiation of embryonic stem cells (Chambers et al., 2003), and according to Wu and Yao (2005), there are no records of Nanog expression in differentiated cells. A reduction in Alox-5 gene expression was also observed in the Lucena cell line, suggesting a differentiation process induced by PMA incubation, but probably not following the megakaryocyte differentiation pathway. Wang and collaborators (2011) studied the synthetic compound Nordy and observed inhibition of the enzyme Alox-5 and attenuated growth of glioma stem-like cells (GSLCs). Nordy also inhibited the auto-renewal and induced GSLCs differentiation in vitro and in vivo. In this same study, a reduction in the gene expression of transcription factors associated with the stem cell state (Nanog, Oct-4 and Sox-2) was observed, suggesting that the transcription of these genes was attenuated in the astrocytic differentiation process. The fact that the expression of some transcription factors was unaltered in the present study may be explained by the study of Oliveira and colleagues (2015), in which different mutations of the gene Oct-4 were identified in the K562 and Lucena cell lines. 29 Chen et al. (2009) suggested that Alox-5 is involved in cellular differentiation. According to those authors, the Alox-5 gene appears to be a key target to attenuate the injuries caused by CML. The authors demonstrated that this gene might play an important role in the functional regulation of leukemic stem cells. In that same study, the deficiency of the Alox-5 gene in mice caused an impairment of LSCs function but not of normal hematopoietic stem cells. Recent progress in cancer biology indicates that the eradication of tumoral stem cells is essential for a more effective therapy. Therefore, the inhibition of this gene is associated with cell differentiation, returning a non-tumoral characteristic to tumoral cells. The Lucena MDR cell line had a higher expression of the stem cell marker gene Oct-4, indicating that this line probably presents more aggressive and invasive characteristics than its parental line K562. Therefore, the presence of a higher number of undifferentiated cells and the MDR characteristic in the Lucena lineage may be responsible for the difficulty in finding therapeutic alternatives for CML. To better understand the relation between differentiation and the cell resistance phenotype, this work presents a comparative study of Alox-5 and Mdr1 gene expression in the K562, Lucena and FEPS cell lines. Interestingly, the results reveal an inverted expression profile for the genes Alox5 and Mdr1 in the different lineages. The data presented in Fig. 4C show that the higher the Alox-5 expression, the lower the Mdr1 expression. These data are in accordance with those of Moreira and co-workers (2014), who have shown by microarray that Mdr1 expression is 287.62 higher in Lucena compared to the K562 lineage. When the expression of the same gene was compared between K562 and FEPS cell lines, FEPS presented an overexpression of 1759.56 compared to the parental line. When the expression of Alox-5 was compared between K562 and FEPS cell lines, the resistant lineage underexpressed the gene 454.14. When the cell line K562 was treated with PMA, the proportion was inverted. PMA treatment increased Mdr1 and decreased Alox5 gene expression. Therefore, the reduction in Alox-5 expression appears to be associated with differentiation in these cells. However, the Lucena cell line, with a lower Alox-5 gene expression, has a higher number of megakaryocytes with no PMA treatment compared to K562 under the same conditions. Therefore, it is possible that the MDR lineage, with a higher number of stem cells (Marques et al., 2010), has a higher differentiation potential. 30 Material and Methods Cell lines and culture conditions K562 cell line were obtained from the Rio de Janeiro Cell Bank (Brazil) and Lucena cell line were obtained from the Tumoral Immunology Laboratory at the Medical Biochemistry Institute of the Federal University of Rio de Janeiro, Brazil. The FEPS cell line was obtained from the Tumoral Immunology Laboratory at the Medical Biochemistry Institute of the Federal University of Rio de Janeiro (Brazil). The cells were grown at 37ºC in 5% CO2 in disposable plastic flasks containing RPMI1640 (Gibco, São Paulo, Brazil) medium supplemented with sodium bicarbonate (0.2 g/L) (Vetec, Rio de Janeiro, Brazil), L-glutamine (0.3 g/L) (Vetec), Hepes (25 mM) (Acros, Belgium), fetal bovine serum (FBS-10%; Gibco), 1% antibiotic (penicillin –100 U/mL), streptomycin (100 mg/mL) (Gibco) and antimycotic (amphotericin-B 0.25 mg/mL – Sigma, São Paulo, Brazil). Lucena and FEPS were maintained with 60 nM of vincristine (VCR) (Sigma) and 300 nM of daunorubicin (DNR) (Sigma), respectively. Treatment of cells with PMA The cells K562, Lucena and FEPS were grown for 2, 3 and 4 days before the beginning of the all experiments, respectively (Trindade et al., 1999; Daflon-Yunes et al., 2013). The cells were then centrifuged, washed twice with PBS (Ca+2–Mg+2-free), re-suspended in RPMI 1640 medium and maintained in 24-well culture plates (to 5×105 cells/mL). For cell differentiation, a stock solution of phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma) in dimethyl sulfoxide (DMSO) (Synth) was prepared and diluted in medium to the concentrations of 0.1, 1, 10, 100 and 1000 nM of PMA. The control cells (not treated) received DMSO at 0.06% (final concentration used in the treatment with the higher PMA concentration). In some of the experiments, the classic inhibitor of P glycoprotein, Verapamil (VP), was used at 5 µM and the chemotherapy drug VCR at 60 nM. Cell viability assay Cell viability was determined by trypan blue exclusion assay immediately (0 h), 24, 48 and 72 h after incubation with PMA in K562 and Lucena cells. The cell viability 31 of the Lucena lineage treated with PMA was also analyzed in the presence of verapamil or vincristine. Cytology The cells K562 and Lucena (5×105 cells/mL) were treated with PMA at 1 or 10 nM and then incubated for 48 or 24 h, respectively. Lucena cells were also treated with PMA at 10 nM and verapamil. The volume of 1.2 mL of the resuspended samples was concentrated by sedimentation for 1 h at environment temperature in 1.5 mL microtubes. Then, using a micropipette, 50 µL from the precipitate was transferred to a microscope slide and spread unilaterally. After drying at environment temperature, the cells were stained with the panoptic dye for hematology (Laborclin). The slides were analyzed by optical microscopy (Olympus® BX 51; América INC., São Paulo, Brazil) using an ocular lens with 10x magnification and a 100x objective and the software Image J for image pixel analyze in the images. The images were documented using a photographic camera (Olympus® DP72; América Inc., São Paulo, Brazil). The megakaryocyte frequency in the slides was evaluated by identifying these cells based on the normal morphology of mature cells and then dividing by the total of cells analyzed. This analysis was undertaken using the software Microsoft Office Picture Manager. Rhodamine 123 extrusion To analyze the P-gp efflux pump activity, the Lucena cells (5×105 cells/mL) were treated with PMA at 10 nM and incubated for 24 h. Subsequently, the cells were centrifuged (1100 rpm for 2 min) and washed with PBS. Rhodamine 123 (Sigma) (300 ng/mL) and culture media were added followed by incubation for 60 min. Then, the medium containing Rhodamine 123 was removed and culture medium alone was added for an additional 60 min incubation. Finally, the medium was removed and the cells were resuspended in PBS. Excitation/ emission values were determined using a multiwell plate reader (ELX 800 Universal Microplate Reader; Bio-TEK) at 485/590 nm. 32 Gene expression The cells K562 and Lucena were treated with 10 nM of PMA during 24 hs for gene expression analysis of Oct-4, Sox-2, Nanog, Mdr-1 and Alox-5. The cell lines K562, Lucena and FEPS were analyzed without PMA treatment to compare the basal expression of Mdr-1 and Alox-5. Total RNA was extracted from six samples of each cell line (2×106 cells per sample) according to the manufacturer’s protocol for TRIzol Reagent (Invitrogen, Brazil), and quantified by fluorometry in a QubitTM fluorometer using the Quanti-iTTM RNA Assay Kit (Invitrogen, Brazil). The RNA integrity was determined by electrophoresis in a 1.5% agarose gel stained with ethidium bromide (0.5 µg/mL). The cDNA synthesis was performed by reverse transcription of 2 µg RNA using the High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit (Applied Biosystems, Brazil). Gene expression analysis was performed by real-time quantitative PCR (qPCR). Genespecific primers (Table 1) were designed based on sequences available in GenBank using the Primer Blast tool (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Previously, the PCR amplification efficiency of each primer pair was evaluated by serial dilution reactions where the efficiency of reactions showed the appropriate parameters (Table 1). Ef1a and βactin were chosen as reference genes after stability was confirmed with the geNorm applet (Vandesompele et al. 2002). For gene expression, each sample was analyzed in triplicate using the ABI 7500 platform Real Time Systems (Applied Biosystems, Brazil) and the detection system Platinum SYBR Green qPCR SuperMix (Invitrogen, Brazil). The normalization factor was calculated as the geometric mean of the expression values of the reference genes tested by the geNorm applet. Relative expression levels of the target genes were calculated by dividing the expression value of the target gene by the normalization factor. Statistical analysis The data normality and variance homogeneity were previously tested. Analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey’s post hoc test was applied to all analyses, except for gene expression, when the t-test was used. The results are expressed as the mean±S.E.M. Each experiment was performed three times in triplicate in each experiment and the significance level was fixed at p<0.05. 33 Acknowledgements The authors would like to thank Dr. Vivian Rumjanek (Tumoral Immunology Laboratory at the Medical Biochemistry Institute of the Federal University of Rio de Janeiro, Brazil) for providing the Lucena and FEPS cell lines. Competing interests The authors declare no competing or financial interests. Author contributions M.C.D. maintained the cell lines, performed the Rhodamine 123 extrusion, prepared the RNA samples, ran quantitative real-time PCR, analyzed data, wrote the manuscript and prepared figures; L.K.A. maintained the cell lines, executed the cell line assays and prepared the cells for histological analysis; J.L.P. prepared the slides and undertook the morphological analysis of the resulting images; D.V.A. prepared the RNA samples, ran quantitative real-time PCR, analyzed data, contributed to the manuscript writing and prepared tables; L.F.M. contributed by providing real-time PCR reagents, analyzing data and helping with the manuscript writing; A.P.S.V. analyzed data and contributed to the manuscript writing; and G.S.T. analyzed data and contributed to the manuscript writing. Funding This work was supported by the Brazilian agencies: CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) and CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior). 34 References Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. and Watson, J. D. (1997). Biologia molecular da célula. 3ed. Porto Alegre: Artes Médicas. Atari, M., Barajas, M., Hernández-Alfaro, F., Gil, C., Fabregat, M., Padró, E.F., Giner, L. and Casals, N. (2011). Isolation of pluripotent stem cells from human third molar dental pulp. Histol. Histopathol. 26, 1057-1070. Bonnet, D. and Dick, J.E. (1997). Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat. Med. 3, 730–737. Butler, T. M., Ziemiecki, A. and Friis, R. R. (1990). 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Cell Res. 15, 317-324. 39 Table 1 -Primers sequences used in gene expression analysis Primers sequence 5’ – 3’ Gene GenBank accession Primers Efficiency(%) number OCT-4 F: TTCCCCATGGCGGGACACCT 96,09 NM_002701 96,01 NM_024865 R: CCCCTGGCCCATCACCTCCA NANOG F: GGTGTGACGCAGAAGGCCTCA R: AGTCGGGTTCACCAGGCATCC MDR1 F: TCCTCAGTCAAGTTCAGAGTCTTCA 102,01 NM_000927 R: TCTCCACTTGATGATGTCTCTCACT ALOX-5 F: GTGGCGCGGTGGATTC 94,99 XM_011539564 103,91 NM_003106 103,38 NM_001101 103,14 NM_001402 R: TGGATCTCGCCCAGTTCCT SOX2 F: AAAAACAGCCCGGACCGCGT R: CTCCTGGGCCATCTTGCGCC ΒACTIN F: CCACCCCACTTCTCTCTAAGGA R: ACCTCCCCTGTGTGGACTTG Ef1a F: GCCAGTGGAACCACGCTGCT R: ATCCTGGAGAGGCAGGCGCA OCT-4: POU class 5 homeobox 1 (POU5F1) transcription factor; NANOG: homeoprotein Nanog transcription factor ; MDR1: ATP-binding cassette, sub-family B (MDR/TAP), member 1 (ABCB1); ALOX-5: arachidonate 5-lipoxygenase (5-LO); SOX-2: Sox-2 transcription factor βACTIN: Beta Actin; Ef1a: eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1 40 Figures Fig. 1. Treatment of erythroleukemic cell lines K562 and Lucena with PMA. Number of viable cells from K562 (A) and Lucena (C) cell lines, and cell viability (%) of K562 (B) and Lucena (D) cells treated with different concentrations of PMA at different times of exposure, as determined by trypan blue exclusion. The results are expressed as means ± S.E.M. *p<0.05 compared to time 0 h. 41 Fig. 2. Analysis of cellular morphology with panoptic dye for hematology of K562 and lucena cell lines. The K562 cells (non-MDR) without treatment (A) and treated with PMA at 10 nM for 24 h (B). Lucena cells (MDR) without treatment (C) and treated with PMA at 10 nM for 24 h (D). Arrows indicate megakaryocytic cells. (E) Frequency of megakaryocytes in both lineages treated with PMA at 1 and 10 nM for 48 and 24 h of incubation, respectively. Different letters indicate significant differences between the means of each cell line (p<0.05). * indicates significant differences between the control groups of both cell lines. (p<0.05). 42 Fig. 3. Relation between PMA and the activity of the ABCB1 efflux pump. (A) Frequency of megakaryocytes in the Lucena cell line treated during 24 h with PMA at 10 nM and/or 5 µM of Verapamil (VP), the inhibitor of P glycoprotein. (B) Evaluation of P glycoprotein activity by Rhodamine 123 (Rho) dye extrusion in the Lucena cell line after treatment with PMA at 10 nM for 24 h. K562 cells did not receive treatment and was used as a control to show the intracellular fluorescence caused by Rhodamine 123 accumulation. The results are expressed as means ± S.E.M. Different letters indicate significant differences between means compared to the control group (p<0.05). (C) Cell viability of the Lucena cell line treated with VP at 5 µM and/or PMA at 10 nM and/or Vincristine (VCR) at 60 nM using trypan blue immediately at 24 h, 48 h and 72 h after incubation. The results are expressed as means ± S.E.M. Different letters show significant differences at each treatment (p<0.05). 43 Fig. 4. Relative gene expression of genes in non-MDR and MDR cell lines. Relative gene expression of Oct-4, Sox-2 and Nanog, P-gp coding gene (Mdr1) and arachidonate 5-lipoxygenase (5-LO) (Alox-5) gene in non-MDR K562 cell line (A) and MDR Lucena (B) treated with PMA at 10 nM for 24 h. (C) Comparison of Alox-5 and Mdr1 gene expression in the lineages K562 (non-MDR), Lucena (MDR) and FEPS (MDR). Different letters indicate significant differences between the means of each gene (p<0.05). 44 Artigo 2 Influence of Oct4 pseudogene on MDR phenotype of erytroleukemic cells (Artigo a ser submetido à Journal of Cell Science) 45 Influence of Oct4 pseudogene on MDR phenotype of erytroleukemic cells Michele Carrett-Dias a,f, Leda Karine Almeidaa, Daniela Volcan Almeidab, Micheli da Rosa Castrof, Marcelo Alves Vargase,f, Robert Boylea,f, Raphael Silveira Vidal c, Vivian M. Rumjanekd, Luis Fernando Marins b,f, Ana Paula de Souza Votto a,f*, Gilma Santos Trindade a,f a Laboratório de Cultura Celular, Universidade Federal do Rio Grande - FURG, Rio Grande, RS, Brazil. b Laboratório de Biologia Molecular, FURG, Rio Grande, RS, Brazil. c Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro, RJ, Brazil. d Laboratório de Imunologia Tumoral, Instituto de Bioquímica Médica, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro, RJ, Brazil. e Laboratório de Histologia, FURG, Rio Grande, RS, Brazil. f Instituto de Ciências Biológicas, FURG, Rio Grande, RS, Brazil. * Corresponding author: Votto, A. P. S. Universidade Federal do Rio Grande - FURG, Instituto de Ciências Biológicas, Av. Itália, Km 8, 96201-900, Rio Grande, RS, Brazil. E-mail: [email protected] 46 Abstract The transcription factor Oct4 has been associated with the multidrug resistant (MDR) phenotype in erythroleukemic cells. This factor has been reported to possess six pseudogenes. Currently, pseudogenes has received more attention because some of its proteins have been shown to be functional. Some of these pseudogenes have been found in cancer cells. In the present study we evaluated the effect of silencing of Oct4 - pg1 pseudogene in gene expression and multidrug resistance phenotype (MDR) in Lucena cell line. The silencing of Oct4 –pg1 reduced expression of both Mdr1 gene (encoding the P-glycoprotein (P-gp)) and protein. The expression of Oct4 gene was not affected, but silencing reduced the expression of its protein. Although, silencing has affected the expression of P-gp, a Lucena silenced cell line not become sensitive to vincristine. The results show that the pseudogene can have or a direct effect on the expression of P-gp or indirect, via oct4. Keywords: Oct4-pg1, K562, cancer stem cells, P-glycoprotein 47 Introduction A pseudogene is a gene copy that does not produce a functional, full-length protein (Vanin, 1985). Pseudogenes originated from reverse transcription of normal mRNA transcripts are named processed pseudogenes and those resulted from gene duplication are called nonprocessed pseudogenes (Mighell et al., 2000; Suo et al., 2005). Some pseudogenes can play regulatory roles over the genes from which they are originated (Hirotsune et al., 2003; Korneev et al., 1999). Hirotsune et al. (2003) showed that the pseudogene MAKORINP1 regulate the expression of MAKORIN1 gene throght its mRNA stability. Oct4 (official symbol POU5F1, also known as Oct3) is an important member of Oct protein family, which is well known by its specific POU DNA binding domain and its diverse functions (Scholer, 1991). The human OCT4 gene encodes three distinct transcripts trought alternative splicing: Oct4A, Oct4B and Oct4B1. These spliced variants share the same domains but have distinct N termini. Oct4A (also called Oct4 only) is highly expressed in the nucleus of compacted embryos and blastocyst, and acts as a main regulator in maintaining the pluripotency and self-renewal capacities of ES (embryonic stem) and EG (embryonic germ) cells (Guo et al., 2012; Nichols et al., 1998; Rosner et al., 1990). Moreover, Oct4 is also related to the status of stem cells in the same way as Sox-2 and Nanog (Chambers and Tomlinson, 2009). Changes in the expression of these genes may define differentiation, dedifferentiation or self -renewal of embryogenic stem cells (Chambers et al., 2003; Karwacki-Neisius et al., 2013; Niwa et al., 2000; Rodda et al., 2005). Oct4 gene has six pseudogenes proposed by bioinformatics approach namely: Oct4-pg1, Oct4-pg2, Oct4-pg3, Oct4-pg4, Oct4-pg5, and Oct4-pg6 (Pain et al., 2005). Among the Oct4 pseudogenes, Oct4-pg1, Oct4-pg3 and Oct4-pg4 share a high sequence similarity when compare to Oct4A (Oct4), sharing the unique N-terminal coding sequence (Redshaw and Strain, 2010). Only adult, noncancer cell type that has been reported to express pseudogenes are cells derived from peripheral blood (Bhartiya et al., 2012). According Suo and collaborators (2005) an Oct4 pseudogene localized in human chromosome 10 (named as Oct4-pg5) and a pseudogene in human chromosome 8 (named as Oct4-pg1) were transcribed in cancers but not in embryonic carcinoma cells, fibroblast cells, and normal tissues tested. According to these authors the transcription of Oct4-pg5 and Oct4-pg1 in cancers 48 maybe involved the regulation of the Oct4 gene activity and thus might be pertinent to carcinogenesis. It should be considered that activation of certain genes is required for selfrenewal, proliferation and differentiation of the stem cell listed above and cancer stem cell. Among the various transcription factors associated with pluripotency in stem cells, Oct4, Nanog and Sox2 are essential for the indefinite division of stem cells without affect neither the differentiation potential nor their self –renewal capacity (Atari et al., 2011). Some studies have associated the expression of Oct4 with the MDR phenotype. To induce resistant erythroleukemic cell lines, Rumjanek et al. (1994; 2001) and Daflon-Yunes et al. (2013) established models in vitro using the K562 cell line, selecting its resistance to chemotherapic drugs as vincristine and daunorubicin. These erythroleukemic cell lines were named K562-Lucena1 (Lucena) and FEPS, respectively, being regarded as interesting models for the study of the mechanisms involved in multidrug resistance (MDR). Marques et al. (2010) reported that Lucena cells showed higher expression of Oct4 and Mdr1 (Abcb1) genes in comparison to its non-MDR parental cell line K562. There are several factors that can lead to MDR phenotype, but the overexpression of Abcb1 (coding for P-glycoprotein, P-gp) (Sonneveld and Wiemer, 1997) is the mechanism best studied. P-gp is expressed on the cell membrane, responsible for efflux mechanism, energy-dependent, capable of pumping chemotherapeutic agents out of the cell (Uchiumi et al., 1993). This study aimed to knock-down the Oct4–pg1 pseudogene and assessing its effect on gene expression and MDR phenotype of erythroleukemic Lucena cell line. 49 Results Basal expression of Oct4, Sox -2 and Nanog gene differs among MDR and non- MDR cell lines Basal expression of Oct4, Sox -2 and Nanog can be seen in Fig. 1. The cell line K562 (non-MDR) had a lower expression of Oct4 and Sox -2 genes compared to both MDR cell lines (Lucena and FEPS). However, expression of Nanog gene in K562 cells was higher compared with Lucena lineage. The transcription factors gene expression seem to keep the same level of MDR cell lines expression. Basal expression of Oct4 protein differs from the constitutive gene expression Using flow cytometer we verified the presence of Oct4 protein in the cell lines studied. As shown in Fig. 2, non-MDR strain showed a tag for Oct4 protein similar to that shown by line FEPS and higher than the other MDR cell line, Lucena. These results are contrary to those found for the gene expression of Oct4 (Fig. 1). Silenced Lucena cells in Oct4-pg1 pseudogene decreased the expression of Mdr1 gene. The silencing of Oct4-pg1 pseudogene reduced expression of the Mdr1 gene that encoding P-glycoprotein and increased expression of Sox-2 transcription factor (Fig. 3). The expression of the other genes have not changed with silencing. The expression of Oct4 gene RT- PCR could be prone to artifacts generated by pseudogene transcripts; thus, we were careful to design specific primers to amplify the genes of interest, with resulting sequences from the research in the NCBI site using program Primer BLAST (Table 1). The Oct4-pg1 pseudogene silencing reduced the Oct4 protein amount The POU5F1B-shRNA lineage (silenced) presented an increased of part of the population (8.64%) unmarked for Oct4 protein when compared to MOCK shRNA cell line (control) (0.98%) (Fig. 4). Intracellular marking of Oct4 protein To confirm the results obtained in flow cytometry (Fig. 2; Fig. 4) and check the intracellular localization of Oct4 protein in K562, Lucena, Lucena Mock-shRNA and Lucena POU5F1B-shRNA cell lines was used immunocytochemistry assay. The 50 K562 and Lucena cell lines (Fig. 5) showed nuclear staining with the anti- Oct4 antibody according to the immunocytochemical data. K562 cells seem to have a more marked "strong" that Lucena cell line, confirming the data obtained by flow cytometry (Fig. 2). The Lucena Mock-shRNA and POU5F1B-shRNA cell lines had a shown nuclear staining less intense than K562 cell line. The marking of Lucena Mock-shRNA strain was similar to found in Lucena, and POU5F1B-shRNA strain did not show labeling (Fig. 5). This data is in agreement with the results obtained in flow cytometry (Fig. 4). Pseudogene Oct4-pg1 can influence the ABCB1 protein expression in Lucena cell line The ABCB1 expression was assessed using antibody against this molecule to detect differences in expression levels. As can be seen in Fig. 6, the silencing of OCT4pg1 pseudogene influence the expression of P-gp resistance protein. It observed the presence of a population unmarked antibody in Lucena POU5F1B lineage-shRNA (41,76%), greater than the unmarked population found in the lineage Lucena MOCK shRNA (21,20%). Silencing of Oct4 - pg1 pseudogene did not alter the sensitivity of Lucena cells to vincristine As viewed in Fig. 7, treatment with 60 nM vincristine for 72 h caused no change in the number of viable cells in the strain Sh-POU5F1B. Vincristine is a known substrate of the Abcb1 and keeps the MDR feature of Lucena cell line. Discussion The Oct4 gene has been extensively studied and most recently, its isoforms and pseudogenes has aroused the interest and received greater attention within the research (Miguell et al., 2000; Pain et al., 2005; Redshaw and Strain, 2010; Scholer, 1991). The study of Oct4 pseudogenes action requires more knowledge to clarify whether a protein is actually inactive or have actions on other genes. Here we report that there is an influence of Oct4-pg1 pseudogene on the Oct4 action and a direct action on the Abcb1 expression or an indirect action by Oct4 via. 51 As already reported by Marques et al (2010), MDR Lucena cell line, has a higher gene expression of Oct4 transcription factor compared to non-MDR parental cell line, suggesting a relationship between this factor and Mdr1 gene. In more recent studies, Wu and colleagues (2014) found a positive correlation between the expression levels of Mdr1 and Oct4 gene in bladder cancer samples. These authors reported that the overexpression of Oct4 increased the expression of MDR. In the present study, this correlation was again confirmed for Lucena cell line, and was further demonstrated for the first time, for the FEPS cell line. As the Oct4, the transcription factor Sox-2 also had a higher expression in MDR cell lines when compared to non- MDR. Moreover, Nanog transcription factor had a smaller expression in Lucena than non-MDR cell line. It was found that the gene expression of transcription factors Oct4, Nanog and Sox-2 have the same expression profile between the MDR cell lines. Still, it was shown that the gene responsible for the expression of Pgp (Mdr1) is more expressed in the FEPS than in Lucena line, confirming the data of Daflon-Yunes and colleagues (2013). Pseudogenes are generally considered to produce nonfunctional proteins (Vanin, 1985). However, some studies have shown certain function for some pseudogenes. Lin and co-authors (2007), suggest that the expression of Oct4 pseudogene can function in mammalian cell line, because in mesenchymal stem cells it promoted the proliferation and inhibit their differentiation to osteochondral. Hayashi et al. (2013) also found a role for the Oct4 pseudogene. According to these authors, the Oct4 pseudogene POU5F1B (Oct4-pg1) when overexpressed in gastric cancer cells promoted the formation of colonies in vitro as well tumorigenicity and tumor growth in vivo and when knockdown resulted in an inhibition of colony formation in vitro and in vivo tumor growth, giving an aggressive phenotype in gastric cancer. In the present work silencing Oct4-pg1 pseudogene reduced expression of the Mdr1 gene that encodes P-glycoprotein (Abcb1). The expression of Abcb1 protein also had a decrease in antibody labeling. However, the expression of the Oct4 gene was not altered by silencing, although the staining with anti-Oct4 antibody showed a reduction in their protein expression. The silencing pseudogene POU5F1B performed by Hayashi et al. (2013) also did not affect the expression of the Oct4 gene in gastric cancer cell. Even without difference in gene expression of Oct4-pg1 pseudogene, it can be assumed that there was a population that silenced showed no labeling for OCT4 52 protein.This population considered silenced was not statistically sufficient to reduce expression of Oct4 gene, but reduced the expression of Oct4 protein. With this result it was possible to suggest there is some influence of the Oct4-pg1 pseudogene with Oct4 protein expression. Another finding in this study was that the cells silenced reduced both genes and protein level expression of Abcb1. We do not know whether this intervention is direct or via Oct4, once time the Oct4 protein was also reduced. In the RT-PCR results of the expression of the Oct4 gene is lower in non MDR cell line, but this strain showed a higher staing for the anti- Oct4 antibody that MDR Lucena cell line. K562 cells lack a great activity of P-gp and this is observed when this cell line cannot withdraw from inside the Rhodamine 123. However, from that same cell line it was possible to give rise to other two, Lucena and FEPS, which express more Mdr1 and Oct4 than the parental lineage. Thus, we can also consider that the K562 cell line have a higher amount of proteins related to transcription factors. Although the results cytometry show a decrease in staing of anti- ABCB1 and gene expression data also show reduction in the expression of Mdr1 gene, the shPOU5F1B cells did not become sensitive to VCR. The VCR is a known substrate of the ABCB1 and keeps the MDR phenotype of Lucena cell line. This may be related to the fact that the Lucena cell line has other resistance mechanisms beyond the overexpression of P-glycoprotein as a higher antioxidant capacity and higher amount of tubulin monomers (Votto et al., 2007; 2010), which allows the cytoskeletal rearrangement, main target of the VCR. In this sense, Daflon-Yunes and collaborators (2013) observed an increase in sensitivity of Lucena 1 and FEPS when Abcb1 gene was silenced, however never reaching the levels of the K562 parental cell line, also these authors suggest that this difference could be due to the fact that other mechanisms are also responsible for the MDR profile observed. The nuclear staining of Oct4 transcription factor in the cells studied is according Cauffman et al. (2006), because according to these authors, the protein Oct4A isoform is found in the nucleus of embryonic stem cells and the antibody used in this study reacts with this protein. Considering this information we can suggest that cell lines tested have the isoform of Oct4 responsible for the stem cells characteristic. Thus the results show a relationship between the Oct4-pg1 pseudogene, the origin Oct4 gene and the gene encoding P-gp. The silencing this pseudogene caused an 53 Oct4 protein decrease and a protein and also gene of Mdr1 decrease, suggesting that the Oct4-pg1 pseudogene can have a direct effect on the expression of P-gp or indirectly, by Oct4 via. Material and methods Cell lines and culture conditions The K562, Lucena and FEPS cell lines were obtained from the Tumoral Immunology Laboratory at the Medical Biochemistry Institute of the Federal University of Rio de Janeiro (Brazil). The cells were grown at 37ºC in 5% CO2 humidified environment in disposable plastic flasks containing RPMI1640 (Gibco) medium supplemented with sodium bicarbonate (0.2 g/L) (Vetec), L-glutamine (0.3 g/L) (Vetec), Hepes (25mM) (Acros), fetal bovine serum (FBS-10%; Gibco), 1% antibiotic (penicillin –100 U/mL) and streptomycin (100 g/mL) (Gibco) and antimicotic (amphotericin-B 0.25 mg/mL – Sigma). Lucena and FEPS were maintained with 60 nM of vincristine (VCR) (Sigma) and 300 nM of daunorubicin (DNR) (Sigma), respectively. Plasmid The POU5F1B SureSilencing shRNA Plasmid (Qiagen, cat. no. KH66786) contains neomycin resistance gene was used. The plasmids were first transformed into competent E.coli cells (Top10 strains), selected with ampicillin, and purified with the Plasmid Maxi-Prep Kit (Qiagen). Plasmid preparations were quantified by fluorometry in a QubitTM fluorometer, using Quanti-iTTM dsDNA Br Assay Kit (Invitrogen). It was used at PstI restriction enzyme (Invitrogen) to confirm the presence of the gene of interest cloned in plasmid. The result was confirmed by electrophoresis in 1.5% agarose gel with ethidium bromide (0.5µg/mL). POU5F1B silencing Lucena cells were silenced for the POU5F1B gene expression by transfection with shRNA plasmids provided in the Qiagen SureSilencing kit (QIAGEN, Dusseldorf, Germany). The POU5F1B shRNA plasmid used was the KH66786. Briefly, 1 x 106 cells were transfected with 2 µg of the POU5F1B -shRNA and mock plasmids using the Amaxa Cell Line Nucelofector Kit V (Lonza, Basel, Switzerland) on an Amaxa 54 Nucleofector II device set on program T-016. Immediately after transfection, cells were incubated in a well of a 12-well microplate at 37 ºC and 5 % CO2. After 24 h, 1 mg/mL of G418 (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) was added for selection of successfully transfected cells. After two weeks, G418 concentration was kept at 0.5 mg/mL in cell culture. Analysis of protein expression by flow cytometry 1x105 cells were fixed with 1 mL BioLegend´s Nuclear Factor Fixation Buffer (BioLegend, San Diego, USA), at room temperature in the dark for 20 minutes. It was washed once with 1 mL BioLegend´s Nuclear Factor Permeabilization Buffer (1x), resuspended with 1 ml BioLegend´s Nuclear Factor Permeabilization Buffer (1x) and kept for 20 min at room temperature in the dark. After incubation, the flurochromeconjugated antibody Alexa Fluor® 488 anti-Oct4 (Oct3) mouse IgG2b, κ Clone 3A2A20 (BioLegend) was added and cells were incubated at room temperature in the dark for 30 minutes. For ABCB1 detection, 1x105 cells were washed with PBS plus 5 % FCS and incubated with FITC mouse anti-human ABCB1 clone 17F9 (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA) at room temperature in the dark for 30 minutes. After 30 minutes in both protocol, cells were washed in PBS plus 5 % FCS, and immediately analyzed by flow cytometer. Ten thousand cells were examined under each condition using a FACSCalibur flow cytometer (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA) and all flow cytometry analysis were accomplished using the Summit software v4.3 (DAKO, Glostrup, Denmark). Sensitivity cell line silenced the VCR Lucena silenced and mock cells were centrifuged, washed twice with PBS (Ca+2–Mg+2-free), suspended in RPMI 1640 medium and maintained in 96-well culture plates (to 5×105 cells/mL). To evaluate the sensitivity, the cells were treated with 60 nM of the chemotherapeutic VCR. Cell viability assay Cell viability was determined by trypan blue exclusion immediately (0 h), 24, 48 and 72 h after incubation of Lucena silenced cells with VCR. 55 Immunocytochemistry assay The slides were prepared by centrifugation of the cultured cells in a cytospin centrifuge (MPW-351R, MPW Med. Instruments). K562 and Lucena cell lines were fixed in Permeabilization Buffer 4% paraformaldehyde and permeabilized with BioLegend Nuclear Factor Fixation. After, the slides were incubated with 5% bovine serum albumin (BSA) for 30 minutes to block nonspecific antigens. The next step was the application of the polyclonal anti-human OCT4 (clone 3A2A20) Alexa Fluor® 488 (BioLegend) (1:500 dilution) on the sections, in dark for 3 days at 4◦C. Finally, 4´-6diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Sigma-Aldrich) (1:10000 dilution) was used to reveal the cell nuclei. A negative control was performed with the same protocol, but without the addition of the anti-human OCT4. Coverslips were mounted using Fluoromount® (Sigma-Aldrich). Slides were observed using confocal microscope. Gene expression Total RNA was extracted from six samples of each cell line with an amount of 2×106 per sample cells according to the protocol of the manufacturer of TRIzol Reagent (Invitrogen, Brazil). The RNAs were quantified by fluorometry in a QubitTM fluorometer, using Quanti-iTTM RNA Assay Kit (Invitrogen, Brazil). The RNA integrity was confirmed by electrophoresis in 1.5% agarose gel with ethidium bromide (0.5µg/mL). cDNA synthesis was performed by reverse transcription of 2 µg RNA using the High Capacity cDNA Reverse Transcriptase kit (Applied Biosystems, Brazil). The gene expression analysis was performed by real-time quantitative PCR (qPCR). Gene-specific primers (Table 1) were designed based on sequences available in GenBank using the Primer Blast tool (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Previously, the PCR amplification efficiency of each primers pair was evaluated by serial dilutions reactions where the efficiency of reactions showed appropriate parameters (Table 1). EF1a and βactin were choosen as reference genes after presented stability when tested with geNorm applet (Vandesompele et al. 2002). For gene expression, each sample was analyzed in triplicate on ABI 7500 platform Real Time Systems (Applied Biosystems, Brazil) using the detection system Platinum SYBR Green qPCR SuperMix (Invitrogen, Brazil). Normalization factor was calculated as the geometric mean of the expression values of the reference genes tested by geNorm applet. Relative expression levels of the 56 target genes are calculated by dividing the expression value of the target gene by the normalization factor. Statistical analysis Analysis of variance (ANOVA), followed by Tukey’s post hoc test, was applied to cell viability analysis. For analysis of gene expression t test was used. The data normality and variance homogeneity were previously tested. The results are expressed as mean±S.E.M. Each experiment was performed three times using triplicates in each experiment significance level was fixed at p<0.05. Competing interests The authors declare no competing or financial interests. Author contributions M.C.D. maintained the cell lines, preparation of plasmid, performed transfection with plasmid, prepared the RNA samples, ran quantitative real-time PCR, executed the cell line assays, performed imunocytochemistry assay, analyzed data, wrote the manuscript and prepared figures; L.K.A. maintained the cell lines; D.V.A. prepared the RNA samples, ran quantitative real-time PCR, analyzed data, contributed to the manuscript writing and prepared tables; M.R.C. performed imunocytochemistry assay and assisted in microscopy; M.A.V. performed imunocytochemistry assay and analysed on microscope slides; R.B. analysed imunocytochemistry blades in the microscope; R.S.V. performed transfection with plasmid, analyzed the protein expression in the cytometer flow; V.M.R. reviewed and discussed the results of flow cytometry; L.F.M. contributed by providing real-time PCR reagents, analyzing data and helping with the manuscript writing; A.P.S.V. analyzed data and contributed to the manuscript writing; and G.S.T. analyzed data and contributed to the manuscript writing. Funding This work was supported by the Brazilian agencies: CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) and CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior). 57 References Asadi, M. H., Mowla, S. J., Fathi, F., Aleyasin, A., Asadzadeh, J. and Atlasi, Y. (2011). OCT4B1, a novel spliced variant of OCT4, is highly expressed in gastric cancer and acts as an antiapoptotic fator. Int. J. Cancer 128, 2645–2652. Atari, M., Barajas, M., Hernández-Alfaro, F., Gil, C., Fabregat, M., Padró, E.F., Giner, L. and Casals, N. (2011). Isolation of pluripotent stem cells from human third molar dental pulp. Histol. Histopathol. 26, 1057-1070. Bhartiya, D., Shaikh, A., Nagvenkar, P., Kasiviswanathan., S., Pethe, P., Pawani, H., Mohanty, S., Rao, S. G. A., Zaveri, K. and Hinduja, I. (2011). Very small embryonic- like stem cells with maximum regenerative potential get discarded during cord blood banking and bone marrow processing for autologous stem cell therapy. 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Physiol. 213, 440-444. 61 Table 1 Primers sequences used in gene expression analysis Gene Primers sequence 5’ – 3’ Primers Efficiency(%) GenBank accession number Oct4 F:TTCCCCATGGCGGGACACCT 96,09 NM_002701 96,01 NM_024865 102,01 NM_000927 99,77 NM_001159542 103,91 NM_003106 103,38 NM_001101 103,14 NM_001402 R: CCCCTGGCCCATCACCTCCA Nanog F:GGTGTGACGCAGAAGGCCTCA R:AGTCGGGTTCACCAGGCATCC Mdr1 F:TCCTCAGTCAAGTTCAGAGTCTTCA R:TCTCCACTTGATGATGTCTCTCACT Oct4-pg1 F: ATGCTTCAGGCACTGTGTTC R: TGTGACCGTATGGCTGTGTG Sox2 F:AAAAACAGCCCGGACCGCGT R:CTCCTGGGCCATCTTGCGCC Βactin F:CCACCCCACTTCTCTCTAAGGA R:ACCTCCCCTGTGTGGACTTG Ef1a F:GCCAGTGGAACCACGCTGCT R:ATCCTGGAGAGGCAGGCGCA Oct4: POU class 5 homeobox 1 (POU5F1) transcription factor; Nanog:homeoproteinNanog transcription factor ;Mdr1: TP-binding cassette, sub-family B (MDR/TAP), member 1 (ABCB1); Oct4-pg1: pseudogene POU class 5 homeobox 1B (POU5F1B): ; Sox-2: Sox-2 transcription factor βactin: Beta Actin; Ef1a: eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1 62 Figures Fig. 1. Relative gene expression of Oct4, Sox -2 and Nanog in non-MDR and MDR cell lines. Comparison of basal expression between lines not MDR K562 and MDR Lucena and FEPS. Different letters show significant differences between means of each Relative gene expression gene (p<0.05). 2.5 K562 Lucena FEPS b 2.0 b b 1.5 b a a,b 1.0 a 0.5 b a 0.0 OCT4 SOX-2 NANOG 63 Fig. 2. Constitutive expression of Oct4 protein. Representative histogram of K562 (black line with transparent background), Lucena (Gray) and FEPS (Black) labeled with anti-Oct4 antibody. Histograms represent the profile of fluorescence. 64 Fig. 3. Relative gene expression of diversos genes of Lucena cell line after POU5F1B silencing. Comparison of expression between the control (mock shRNA) e silencing cells (POU5F1B shRNA). Different letters show significant differences between means of each gene (p<0.05). 65 Fig. 4. Expression of Oct4 on silenced cell line. Representative histogram of Lucena cells (transfected with shRNA or shPOU5F1B) labeled with anti-Oct4 antibody. The empty histograms represents the profile of cells transfected with shRNA (mock controls) in the presence of Oct4 antibody and the striped histograms represent the profile of cells transfected with shPOU5F1B (silenced cells) in the presence of Oct4 antibody. 66 Fig. 5. Immunocytochemistry of OCT4 in eritroleukemic cells. Cells were stained with OCT4 antibody, as indicated. Green–OCT4. 67 Fig. 6. Expression of ABCB1 on silenced cell line. Representative histogram of Lucena cells (transfected with shRNA or shPOU5F1B) labeled with ABCB1 antibody. The empty histograms represents the profile of cells transfected with shRNA (mock controls) in the presence of ABCB1 antibody and the striped histograms represent the profile of cells transfected with shPOU5F1B (silenced cells) in the presence of ABCB1 antibody. 68 Fig. 7. Sensitivity of cells silenced for vincristine. Number of viable cells of control (mock shRNA) and silencing (POU5F1B shRNA) cells treated with 60 nM of VCR at different times of exposure by Trypan Blue exclusion test. Results are expressed as means ± S.E.M. Equal letters do not show significant difference of means of between cell lines (p<0.05). 69 Discussão Geral A plasticidade celular é garantia de inesgotável fonte de pesquisa. Quando pensamos na capacidade de defesa das células frente a diferentes formas de agressão ao ambiente celular, responsável por sua sobrevida e sobrevida do organismo; quando refletimos na presença de células tronco em diferentes fases de maturação, responsáveis pela manutenção e renovação de diferentes linhagens, tecidos, órgãos e sistemas, estamos refletindo sobre a capacidade plástica das células e suas consequentes relações gênicas e proteicas que a justificam. Ainda considerando a plasticidade celular e suas relações, porém agora levando em conta células patológicas, como as tumorais, a abrangência investigativa é, consideravelmente, maior. O presente trabalho analisou alguns aspectos da plasticidade celular em diferentes linhagens leucêmicas. No primeiro artigo foi avaliada uma possível relação entre a diferenciação celular e o fenótipo de resistência a múltiplas drogas (MDR) em células eritroleucêmicas. Sem dúvida, o fenótipo MDR é uma das principais causas de insucesso no tratamento do câncer, e dentro do quadro da busca incessante para o tratamento desta desordem celular, promover a diferenciação tem sido encarado como uma alternativa terapêutica (Melo e Barnes, 2007). Baseado nas publicações que ressaltam que o tratamento com Phorbol-12miristato-13 acetato (PMA) induz a diferenciação megacariocítica na linhagem K562 (Herrera et al., 1998; Hirose et al., 2013; Huo et al., 2006; Murray et al., 1993), este composto foi utilizado no presente estudo. Estes autores utilizaram concentrações variadas de PMA, o que exigiu a construção de uma curva dose/resposta no presente trabalho. Na linhagem não-MDR K562, houve citotoxicidade a partir de 10 nM de PMA, enquanto para a linhagem Lucena esta concentração apenas inibiu a proliferação celular. Já Chen e colaboradores (2011) notaram inibição de proliferação em células K562 tratadas com 80 nM de PMA e relacionaram esta inibição com o aumento de apoptose. Outros autores demonstraram que o tratamento dessas mesmas células com PMA resultou em parada no crescimento celular, poliploidia, mudanças morfológicas e aumento na adesão célula a célula e célula a substrato (Butler et al., 1990; Colamonici et al., 1985; Fukuda 1981; Hocevar et al., 1992; Long et al., 1990; Tetteroo et al., 1984). 70 No presente estudo a concentração de 10 nM de PMA foi capaz de induzir a diferenciação das células K562 para megacariócitos, o que corrobora com os resultados de outros autores (Chen et al. 2011; Herrera et al., 1998). Entretanto, para a linhagem MDR Lucena, esta diferenciação para megacariócitos não foi observada, o que permitiu considerar alguns fatores. De acordo com Hirose et al. (2013) a acumulação intracelular de espécies reativas de oxigênio está envolvida na diferenciação megacariocítica induzida por PMA em células de leucemia K562. Neste sentido, Trindade et al. (1999) e Votto et al., (2007; 2010) demonstraram que as células Lucena possuem mais atividade de enzimas antioxidantes do que a linhagem K562, sugerindo uma menor acumulação intracelular de espécies reativas de oxigênio na linhagem MDR, o que por sua vez poderia estar inibindo a indução de diferenciação para este tipo celular. Outro fator que poderia explicar este resultado pode estar relacionado à grande atividade da bomba de efluxo encontrada na linhagem MDR, a qual poderia estar expulsando o PMA destas células. Importante lembrar que as células Lucena possuem uma expressão do gene MDR1, que codifica a gp-P, em torno de 1400 vezes maior que na linhagem parental K562 (Marques et al., 2010). De fato, pudemos constatar neste estudo que a gp-P não foi inibida pelo tratamento com PMA uma vez que sua utilização não foi capaz de aumentar a fluorescência das células que receberam Rhodamine 123. Para certificarmos que a Lucena realmente não apresenta comportamento semelhante a linhagem K562 quanto à diferenciação, bloqueamos a gp-P com verapamil e esse bloqueio não reverteu em aumento significativo de megacariócitos na linhagem Lucena tratada com PMA. Uma possibilidade é que o PMA não induza diferenciação para megacariócitos na linhagem Lucena, podendo induzir sua diferenciação para outro tipo celular, como eritrócitos, por exemplo. De fato, dentro do desenvolvimento de diferenciação normal dos mieloblastos (lembrando que é este o tipo de célula das linhagens em estudo), o progenitor desta linhagem é comum para as linhagens eritróide e megacariocítica. Este tipo de célula progenitora foi identificado nas linhagens K562 e Lucena, uma vez que ambas apresentaram marcadores de célula-tronco hematopoiética (fenótipo CD34+CD38-) (Marques et al., 2010). 71 Buscando possíveis relações gênicas nos processos de diferenciação foi possível confirmar a presença de populações de células tronco nas linhagens K562 e Lucena, levando em conta a expressão dos fatores de transcrição Oct-4, Sox-2 e Nanog. Na análise, foi observada a expressão reduzida dos genes Nanog e Alox-5 na linhagem K562 tratada com PMA, o que pode estar relacionado com a diferenciação celular observada, uma vez que Nanog é diminuído durante a diferenciação de célula-tronco embriogênica (Chambers et al., 2003), e segundo Wu and Yao (2005) não há relatos sobre a expressão de Nanog em células diferenciadas. Já na linhagem Lucena também foi observada uma redução na expressão do gene Alox-5, podendo sugerir algum processo de diferenciação induzido pela incubação com PMA, mas que, conforme já discutido acima, provavelmente não siga o caminho da diferenciação megacariocítica. Também a linhagem FEPS recebeu tratamento com 10 nM de PMA (dados não mostrados e não submetidos à publicação) e a expressão gênica também foi verificada. Com relação a expressão do gene Alox-5, após o tratamento, não houve expressão desse gene. Este fato pode ser explicado em função da expressão basal desse gene já ser muito baixa. Também nessa linhagem a expressão do gene Oct4 foi reduzida e do gene Nanog não teve diferença após tratamento. Seguindo a linha de análise, pode ser sugerido que a linhagem FEPS também diferenciou. Wang e colaboradores (2011), estudando o composto sintético Nordy, observaram uma inibição da enzima Alox-5 e uma atenuação no crescimento de células tronco de gliomas (GSLCs). Além disso, Nordy inibiu também a auto-renovação e induziu a diferenciação de GSLCs, in vitro e in vivo. Ainda neste trabalho, os autores observaram uma redução na expressão dos fatores de transcrição associados com o estado de célula-tronco Nanog, Oct-4 e Sox-2, sugerindo que a transcrição desses genes foi atenuada no processo de diferenciação astrocítica. No presente estudo, a não alteração de determinados genes após tratamento com PMA, pode estar relacionada com as diferentes mutações identificadas nas linhagens K562 e Lucena para o gene Oct4 (Oliveira et al., 2015). Quanto ao gene Alox-5, Chen et al. (2009) tem relacionado esse gene com a diferenciação celular. De acordo com os autores, o gene Alox-5 parece ser um alvo bem determinante para atenuar os malefícios da LMC. Os autores demonstraram que esse gene parece ter papel importante na regulação funcional da célula-tronco leucêmica (LSCs). No estudo, a deficiência do gene Alox-5 em camundongos causou 72 comprometimento da função de LSCs, mas não em células tronco hematopoiéticas normais. Progressos recentes na biologia do câncer indicam que a erradicação de células tronco tumorais é essencial para uma terapia mais efetiva. Assim, a inibição deste gene está associada à diferenciação celular, devolvendo às células tumorais uma propriedade não tumoral. Constatando que as expressões gênicas da linhagem parental K562 e das células MDR Lucena podem apresentar diferentes perfis, foi realizado um estudo comparativo sobre a expressão dos genes Alox-5 e Mdr1 nessas linhagens, acrescido das expressões destes genes também na linhagem MDR FEPS. Interessantemente, os resultados indicaram um perfil de expressão invertido para os genes Alox-5 e Mdr1 nas linhagens estudadas. O gene Mdr1 foi mais expresso nas células Lucena e FEPS e o Alox-5 menos expresso nessas linhagens quando comparado com a expressão desses genes nas células K562. Estes dados estão de acordo Moreira e colaboradores (2014). Segundo os dados de Microarray apresentados pelos autores, quando comparadas as expressões do gene Mdr1 entre K562 e Lucena, a segunda linhagem apresentou 287.62 vezes superexpresso. Quando comparadas as expressões do mesmo gene entre K562 e FEPS, a segunda linhagem apresentou 1759.56 vezes superexpresso que a linhagem parental. Quando comparada a expressão do gene Alox-5 entre as linhagens K562 e FEPS, a linhagem resistente apresentou 454.14 vezes menos expresso. Além disso, quando tratamos a linhagem K562 com PMA, para induzir a diferenciação, essa relação se inverteu. O tratamento aumentou a expressão do gene MDR1 e diminuiu a expressão do gene Alox-5. Assim a diminuição do gene Alox-5 parece realmente estar associada com a diferenciação nestas células. Ainda neste sentido, cabe considerar que a linhagem Lucena, com menor expressão de Alox-5, apresentou maior número de megacariócitos sem tratamento com PMA quando comparado com a presença dessas células com as mesmas condições na linhagem K562. Assim, é possível perceber que a linhagem MDR, com a presença de um maior número de células tronco (Marques et al., 2010) possui maior potencial de diferenciação. Como já relatado por Marques et al. (2010), a linhagem MDR Lucena, apresenta uma maior expressão gênica do fator de transcrição Oct4 quando comparada com a linhagem parental não-MDR, sugerindo uma relação entre esse fator e o gene Mdr1. Em estudos mais recentes, Wu et al. (2014) encontraram uma correlação positiva 73 entre os níveis de expressão do gene Oct4 e o Mdr1 em amostras de câncer de bexiga. Naquele trabalho, os autores relataram que a superexpressão de Oct4 aumentou a expressão de Mdr1. No presente trabalho, esta correlação foi novamente confirmada para a linhagem Lucena, e ainda foi demonstrada, pela primeira vez, para a linhagem FEPS. Este trabalho também demonstrou que, assim como o Oct4, o fator de transcrição chamado Sox-2 teve uma maior expressão nas linhagens MDR quando comparada com a não-MDR. Por outro lado, o fator de transcrição Nanog teve uma expressão menor na linhagem Lucena do que na linhagem não-MDR. Xin e colaboradores (2013) encontraram resultados semelhantes quanto à expressão dos fatores de transcrição Oct4 e Sox2 nas linhagens K562 (sensível) e K562/A02 (resistente). No presente trabalho a expressão do fator de transcrição Nanog foi maior na linhagem K562, diferente do que foi encontrado por Xin et al. (2013). Foi possível constatar que a expressão gênica dos fatores de transcrição Oct4, Sox-2 e Nanog apresentam o mesmo perfil de expressão entre as linhagens MDR. Ainda, foi demonstrado que o gene responsável pela expressão da gp-P, (Mdr1) é mais expresso na linhagem FEPS do que na linhagem Lucena, corroborando com os dados de Daflon-Yunes, et al. (2013). Como já mencionado acima, o gene Oct4 é um dos principais genes relacionados aos processos de diferenciação e de aquisição do fenótipo MDR. Desta forma, o gene Oct4 é amplamente estudado e suas isoformas e pseudogenes tem despertado interesse nas pesquisas (Miguell et al., 2000; Pain et al., 2005; Redshaw and Strain, 2010; Scholer, 1991). O estudo da ação dos pseudogenes, aqui em especial do gene Oct4, requer mais conhecimento para esclarecer se o produto de sua transcrição é realmente inativo ou se tem alguma ação sobre outros genes. Com este objetivo foi produzido o segundo artigo deste estudo. Os pseudogenes são geralmente sequências de DNA que produzem proteínas não funcionais (Vanin, 1985). Entretanto, alguns trabalhos tem demonstrado certa função para alguns pseudogenes. Lin et al. (2007), sugerem que a expressão de um pseudogene Oct4 pode ser funcional em células de linhagem de mamífero, pois em célula-tronco mesenquimal a sua expressão promoveu a proliferação e inibiu sua diferenciação osteocondral. Também Hayashi e colaboradores (2013) encontraram uma função para o pseudogene 74 Oct4. De acordo com esses autores, o Oct4 pseudogene POU5F1B (Oct4-pg1) confere um fenótipo agressivo no câncer gástrico, pois quando superexpresso foi capaz de promover a formação de colônias in vitro, bem como a formação do tumor e o crescimento do tumor in vivo; por outro lado, seu silenciamento, resultou em uma inibição da formação da colônia in vitro e do crescimento do tumor in vivo. No presente trabalho o silenciamento do pseudogene Oct4-pg1, nas células Lucena, reduziu a expressão do gene Mdr1 que codifica a glicoproteína-P (Abcb1). Esta redução gênica também foi acompanhada de uma diminuição na expressão da proteína Abcb1 na marcação com anticorpo. Não sabemos se essa intervenção é direta ou via Oct4, pois a proteína Oct4 também foi reduzida. Considerando-se o fator de transcrição Oct4, a nível gênico, a expressão do gene Oct4 não foi alterada com o silenciamento, embora a marcação com anticorpo anti-Oct4 tenha mostrado uma redução na sua expressão protéica. A não alteração na expressão gênica corrobora com os resultados obtidos por Hayashi et al. (2013), quando aqueles autores promoveram o silenciamento do pseudogene POU5F1B sem afetar a expressão do gene Oct4. No presente trabalho, demonstrar que houve uma redução na expressão proteica após o silenciamento sugere haver alguma influência do pseudogene Oct4-pg1 com o gene Oct4. Ainda considerando a expressão gênica e proteica do gene Oct4, foi surpreendente constatar que, embora a expressão do gene Oct4 seja menor na linhagem não MDR, o que corrobora com Marques e colaboradores (2010), foi esta linhagem que apresentou uma maior marcação para o anticorpo anti-Oct4. Outra constatação que merece destaque é que embora o silenciamento tenha diminuído a expressão gênica e proteica do gene Abcb1, as células sh-POU5F1B não se tornaram sensíveis a VCR. Este fato sinaliza outros mecanismos de resistência, além da superexpressão da glicoproteína-P para as células Lucena, como uma maior capacidade antioxidante e maior quantidade de monômeros de tubulina (Trindade et al., 1999, Votto et al., 2007 e 2010), o que possibilita o rearranjo do citoesqueleto, principal alvo da VCR. Neste sentido, Daflon-Yunes e colaboradores (2013) observaram um aumento na sensibilidade da Lucena e FEPS quando o gene da ABCB1 foi silenciado, no entanto nunca atingindo os níveis da linhagem celular parental K562. Estes autores também 75 sugerem que esta diferença pode ser devido a outros mecanismos também responsáveis pelo perfil MDR observado. Por fim, a marcação nuclear do fator de transcrição Oct4 nas células estudadas está de acordo com Cauffman et al. (2006). Esses autores demonstraram que a proteína da isoforma Oct4-A é encontrada no núcleo das células tronco embrionárias e o anticorpo utilizado no presente trabalho reage com essa proteína. Considerando essas informações, podemos sugerir que as células estudadas apresentam a isoforma de Oct4 responsável pela característica de célula-tronco. Concluindo, o presente trabalho foi capaz de demonstrar que as células Lucena e FEPS sofrem o processo de diferenciação, porém não seguem a mesma linha evolutiva de sua linhagem parental K562. A diferenciação das células K562 para megacariócitos valida esta afirmação. Neste processo, o gene Alox-5 teve a expressão reduzida nas três linhagens; a expressão do gene Oct4 foi reduzida apenas na linhagem FEPS e do Nanog nas linhagens K562 e FEPS; e o gene Mdr1 teve a sua expressão aumentada na linhagem K562 após o tratamento com PMA. Por fim, foi possível reportar que existe uma relação entre o pseudogene Oct4-pg1, o gene Oct4 e o gene que codifica a gp-P. O silenciamento desse pseudogene, causou uma diminuição na proteína Oct4 e uma redução protéica e gênica do Mdr1, sugerindo que o pseudogene pode ter um efeito direto na expressão da gp-P ou indireto, via Oct4. 76 Bibliografia geral Alberts, B. et al., 2010. Biologia Molecular da Célula. 5.ed. Porto Alegre: Artmed. 1205.p. Atari, M., Barajas, M., Hernández-Alfaro, F., Gil, C., Fabregat, M., Padró, E.F., Giner, L. and Casals, N. (2011). Isolation of pluripotent stem cells from human third molar dental pulp. Histol. Histopathol. 26, 1057-1070. Atlasi, Y., Mowla, S. J., Ziaee, A. M., Gokhale , P. J. and Andrews, P. W. (2008). OCT4 spliced variants are differentially expressed in human pluripotent and nonpluripotent cells. Stem Cells 26, 3068–3074. Barancíki, M., Stefanková, Z. and Breier, A. (1995). Effect of phorbol myristate acetate (PMA) on P-glycoprotein mediated vincristine resistance of L1210 Cells. Gen. Physiol. Biophys. 14, 171—175. Beachy, P.A., Karhadkar, S. S. and Berman, D. 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