PLACA TERASAKI PARA - Biometrix

FAMÍLIA HLA SOROLÓGICO DE CLASSE II
Instruções de Uso
APRESENTAÇÃO E COMPOSIÇÃO DA FAMÍLIA
Código
MDR172
CDR5
CDR50
Descrição
Placa de Tipagem de Tecido Monoclonal Classe II - HLA
MDR172 - 10 placas
Complemento de Coelho para HLA Classe II - CDR5 - 1 x 5 mL
ABSG
Complemento de Coelho para HLA Classe II - CDR50 - 1 x 50 mL
Complemento de Coelho para HLA Classe II Liofilizado CDR1D - 1 x 1 mL
Reagente Controle Antilinfócito B IgG - ABSG - 1 x 1 mL
ABSM
Reagente Controle Antilinfócito B IgM - ABSM - 1 x 1 mL
FB2-100
Reagente de Isolamento (separação) - FB2-100 - 1 x 10 mL
Reagente Fosfato Salino Tamponado PBS/Citrato - PC1500 - 1 x 500 mL
Reagente Controle Negativo - NS - 1 x 1 mL
CDR1D
PC1-500
NS
USO PRETENDIDO
A Placa para Tipagem de HLA Terasaki é uma placa de poliestireno
com 60, 72 ou 96 poços contendo anticorpos alo ou monoclonais
conhecidos contra antígenos HLA. Cada poço contém 1 µL de um antissoro
específico ou anticorpo monoclonal e 5 µL de óleo mineral. Cada placa
contém um controle positivo e um negativo. Para uso na determinação de
antígenos HLA classe II na superfície da célula através da metodologia de
microlinfocitotoxicidade dependente de complemento.
Os controles ABSG, ABSM e NS são usados para testar a pureza das
preparações celulares. Podem também ser usados em combinação para
identificar a contaminação de preparo de células.
Os complementos CDR5, CDR50 e CDR1D são utilizados em ensaios
de citotoxicidade dependentes de complementos para determinar os
antígenos HLA de Classe II da superfície celular.
1
O componente FB2-100 (Fluorobeads B) fornece um procedimento
simples para o isolamento de Linfócitos B para uso em testes de tipagem
HLA classe II usando corantes fluorescentes.
O componente PC1-500 (PBS/Citrato) é um reagente para ser usado
no método de isolamento Fluorobeads B (FB2-100).
Esses materiais são para uso em laboratório de imunologia na
tipagem HLA. Através desse teste determina-se a compatibilidade HLA
entre indivíduos e, por isso, esse teste é denominado de teste de
histocompatibilidade.
PRINCÍPIO DE AÇÃO E REAÇÃO DO PRODUTO
Os linfócitos viáveis são incubados com uma mistura de anticorpos
ligados a um complemento. Se o linfócito possuir um antígeno reconhecido
por um anticorpo específico, a porção FAB do anticorpo se liga ao antígeno,
formando um complexo antígeno-anticorpo. Após a formação desses
complexos, com a fração C1q e o Ca++ do complemento, ligam-se à porção
FC do anticorpo.
Um anticorpo IgM é necessário para ligar uma molécula C1q, ou dois
anticorpos IgG são necessários para ligar uma molécula C1q. A ligação C1q
inicia a cascata do sistema complemento, a qual induz a uma lise da célula
com o complexo antígeno-anticorpo. Em uma reação negativa os linfócitos
se mantêm viáveis. Em uma reação positiva os linfócitos estão mortos.
2
COMPONENTES FORNECIDOS E NÃO FORNECIDOS
Código
Material Fornecido
1) 10 placas de Tipagem de Tecido
Monoclonal Classe II - HLA MDR172;
2) Worksheets identificando a
especificidade de cada anticorpo
monoclonal;
3) Instruções de uso.
MDR172
CDR-5
CDR-50
CDR-1D
ABSG
ABSM
NS
1)
1 frasco com 5 mL de
Complemento de Coelho para HLA
Classe II;
2)
Instruções de uso.
1)
1 frasco com 50 mL de
Complemento de Coelho para HLA
Classe II;
2)
Instruções de uso.
1)
1 frasco com 5 mL de
Complemento de Coelho para HLA
Classe II Liofilizado;
2)
Instruções de uso.
1)
1 frasco com 1 mL de
Reagente Controle Antilinfócito B IgG;
2)
Instruções de uso.
1) Reagente Controle Antilinfócito B
IgM - ABSM - 1 x 1 mL;
2) Instruções de uso.
1) 1 frasco com 1 mL de Reagente
Controle Negativo;
2) Instruções de uso.
Materiais necessários, mas não fornecidos
1) Microsseringas HLA (micro dispensadores/dosadores);
2) Insta-Seal (OLI cat. TIS250U) lâminas cobertas ou
lâminas de vidro e óleo mineral (Vaseline);
3) Reagentes corantes e fixadores:
- Para teste de exclusão de corante: eosina-Y (base
sódica) e formaldeído, ou Stain-Fix (cat. SF-500 da
One Lambda);
- Para teste fluorescente: FluoroQuench AO/EB (cat.
# FQAE-500 da One Lambda).
4) Eliminação da Hemoglobina:
- De soro bovino liofilizado: EDTA PBS a 5%; azida
sódica a 1%.
- De células vermelhas totais: solução salina; EDTA
PBS a 5%; solução azida a 1%.
5) Solução a 1% de tinta: soro albumina bovino (BSA);
EDTA PBS 5%; azida sódica; tinta preta de caligrafia
Higgins;
6) Solução 5% EDTA (dissódico) PBS;
7) Solução estoque de Brometo de etídio (EB): água
destilada; PBS;
8) Diacetato de carboxifluoresceína (CFDA);
- Solução stock: Dissolva 10 mg de CFDA em 1 mL de
acetona num tubo de vidro. Armazene a –20°C em tubos
de Beckman.
- Solução de trabalho: Use uma das seguintes:
 Preparado em PBS a pH 7,2: Acrescente 30 μl de
solução stock CFDA a 5 mL de PBS (pH 7,2). Armazene
a 2–5°C durante um período máximo de 1 semana.
 Preparado em PBS a pH 5,5: Acrescente 30 μl de
solução stock CFDA a 5 mL de PBS (pH 5,5). Armazene
a 2–5°C durante um período máximo de 1 semana.
Não aplicável.
Não aplicável.
Não aplicável.
Não aplicável.
Não aplicável.
Não aplicável.
3
Código
FB2-100
Material Fornecido
1) 1 frasco com 10 mL de Reagente
de Isolamento (separação);
2) Instruções de uso.
PC1-500
1) 1 frasco com 500
Reagente
Fosfato
Tamponado PBS/Citrato;
2) Instruções de uso.
mL de
Salino
Materiais necessários, mas não fornecidos
1) Placas de tipagem tecidual de classe II (One Lambda
ou equivalentes);
2) Tubos de vidro ou plástico para centrífuga, de 5 mL
e 1,5 mL, com tampas;
3) Solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem
Ca++ e Mg++ (ou seja, Irvine Scientific, Nº de
Catálogo 9249);
4) Meio de McCoy ou equivalente com HIFCS a 5%;
5) Separador magnético (One Lambda ou equivalente);
6) Aspirador ou pipetas descartáveis;
7) Reagente PBS/Citrato:
- Número de catálogo OLI PC1-500, ou
- Reagente PBS/Citrato
(1) Solução stock (10X Citrato): Dissolva 7 g de citrato
trissódico dihidratado e 2,5 g de ácido cítrico em 90
mL de água destilada. Perfaça um volume final de 100
mL. Filtre, esterilize e armazene entre 2 a 5°C.
(2) Solução de trabalho (1X PBS/Citrato): Adicione 10
mL de 10X citrato a 90 mL de PBS. Filtre, esterilize e
armazene entre 2 a 5°C.
8) Soro fetal de bezerro inativado pelo calor (HIFCS)
- Solução stock: Aqueça o FCS a 56°C durante 30
minutos para inativar o complemento. Armazene a
uma temperatura entre 2 a 5°C ou aliquote e
congele a –20°C;
- Solução de trabalho: Adicione 5 mL de solução
stock de HIFCS a 95 mL de meio de McCoy ou
equivalente.
1) Placas de tipagem tecidual de classe II (One Lambda
ou equivalentes);
2) Tubos de vidro ou plástico para centrífuga, de 5 mL
e 1,5 mL, com tampas;
3) Solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem
Ca++ e Mg++ (ou seja, Irvine Scientific Nº de Catálogo
9242);
4) Meio de McCoy ou equivalente com HIFCS a 5%;
5) Separador magnético (One Lambda ou equivalente);
6) Aspirador ou pipetas descartáveis;
7) Reagente PBS/Citrato:
- Número de catálogo OLI PC1-500, ou
- Reagente PBS/Citrato
(1) Solução stock (10X Citrato): Dissolva 7 g de citrato
trissódico dihidratado e 2,5 g de ácido cítrico em 90
mL de água destilada. Perfaça um volume final de 100
mL. Filtre, esterilize e armazene entre 2 a 5°C.
(2) Solução de trabalho (1X PBS/Citrato): Adicione 10
mL de 10X citrato a 90 mL de PBS. Filtre, esterilize e
armazene entre 2 a 5°C.
8) Soro fetal de bezerro inativado pelo calor (HIFCS)
- Solução stock: Aqueça o FCS a 56°C durante 30
minutos para inativar o complemento. Armazene a
uma temperatura entre 2 a 5°C ou aliquote e
congele a –20°C;
- Solução de trabalho: Adicione 5 mL de solução
stock de HIFCS a 95 mL de meio de McCoy ou
equivalente.
4
Instrumentos Necessários e Não Fornecidos
 Microscópio de contraste de fase, que poderá ser invertido e com
fluorescência, dependendo da metodologia utilizada para separação de
linfócitos.
Em
caso
de
dúvidas,
sempre
consulte
a
Biometrix
Diagnóstica.
CONDIÇÕES
DE
ARMAZENAMENTO,
TRANSPORTE,
LIMITES
DE
TEMPERATURA, UMIDADE OU PROTEÇÃO À LUZ
A validade e as condições de armazenamento e transporte de cada
um dos produtos pertencentes a esta família estão indicados a seguir:
Código do
produto
MDR172
CDR-5
CDR-50
CDR-1D
ABSG
ABSM
NS
Informações sobre transporte
Os produtos devem ser transportados
congelados, acondicionados com gelo seco.
Os produtos devem ser transportados
congelados, acondicionados com gelo seco.
Os produtos devem ser transportados
congelados, acondicionados com gelo seco.
Os produtos devem ser transportados
refrigerados, acondicionados com gelo reciclável.
Os produtos devem ser transportados
congelados, acondicionados com gelo seco.
Os produtos devem ser transportados
congelados, acondicionados com gelo seco.
Os produtos devem ser transportados
congelados, acondicionados com gelo seco.
Temperatura de
armazenamento
-65°C ou inferior
-65°C ou inferior
-65°C ou inferior
2°C-8°C
-20°C ou inferior.
-20°C ou inferior.
-20°C ou inferior.
FB2-100
Os produtos devem ser transportados
refrigerados, acondicionados com gelo reciclável.
2°C-8°C
PC1-500
Os produtos devem ser transportados
refrigerados, acondicionados com gelo reciclável.
2°C-8°C
Caso o material esteja congelado, somente descongelar o que será
imediatamente utilizado. Se necessário, aliquotar o conteúdo em tubos de
menor volume. Esse volume deve ser determinado por cada laboratório,
pois é dependente da rotina de cada um.
PRECAUÇÕES
Somente para uso em diagnóstico in vitro.
Cuidados especiais: quando manusear o produto, utilizar luvas
descartáveis.
5
Descartar se houver descongelamento prematuro.
CUIDADO: Todos os produtos de origem sanguínea devem ser tratados
como potencialmente infecciosos. A fonte de material do qual esse produto
foi derivado foi dada como negativa quando testada de acordo com os
requerimentos para testes pela FDA. Nenhum método de teste conhecido
pode assegurar que produtos derivados de sangue humano não transmitirão
agentes infecciosos.
Não
existem
padrões
Americanos
que
indiquem
potência
ou
especificidade.
CUIDADOS COM A AMOSTRA BIOLÓGICA OBJETO DO DIAGNÓSTICO
Por se tratar de material para teste diagnóstico, que envolve amostra
de origem sanguínea humana, manipular como material potencialmente
infeccioso.
PROCESSO DE MEDIÇÃO
Coleta e Preparo da Amostra
a. Sangue armazenado por menos de 24 horas: coloque 15-20 mL de
sangue total em heparina de sódio (1000 unidades/10 mL de sangue)
em tubo “Vacutainer”, tampa verde.
b. Sangue armazenado por mais de 24 horas: coloque 15-20 mL de
sangue total em tubo “Vacutainer” ACD ou CPDA.
c.
Não use heparina de lítio. IMPORTANTE: o sangue deve ser
armazenado horizontalmente entre 22 e 25°C. Não refrigere.
Isolamento de Linfócito a Partir de Sangue Fresco
a.
Centrifugue o sangue citrificado ou heparinizado por 10 minutos a 400 g.
b. Colete a camada tamponada e dilua em volume igual de PBS (fosfato
salino tamponado); misture bem.
6
c.
Espalhe o máximo de 2 mL da mistura da camada tamponada/PBS
sobre 1,5 mL de Ficoll-Hypaque em tubos de 5 mL e centrifugue por
10 minutos a 1000 x g.
d. Colete aproximadamente 1 mL da interfase de cada tubo e transfira
para tubos tipo “Fisher”. Centrifugue por 1 a 1 ½ minuto a 3000 x g
em uma centrífuga do tipo “Fisher”.
e. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o concentrado em PBS.
Centrifugue por 1 min a 1000 x g (isso remove a maioria das
plaquetas).
f.
Descarte o sobrenadante, ressuspenda o concentrado em PBS, e
então, adicione 1 gota de trombina (100 unidades/mL). Misture.
g. Coloque os tubos para girar em uma roda vertical a 8 RPM ou inverta
os tubos por 2-5 minutos, ou até que apareçam agregados brancos.
h. Centrifugue por 3 minutos a 1000 x g em uma centrífuga do tipo
“Fisher” e transfira o sobrenadante para limpar os tubos “Fisher”. Os
agregados remanescentes podem ser poupados para o procedimento
de isolamento de monócitos. Centrifugue o sobrenadante por 1
minuto a 1000 x g.
i.
Descarte o sobrenadante e ressuspenda o concentrado por 1 minuto
a 1000 x g. Repita.
j.
Ressuspenda o concentrado em meio de McCoy e ajuste as células
para uma concentração de 2x106 células/mL de linfócitos totais para
tipagem.
Separando/Isolando Linfócitos B
Atualmente, existem diferentes procedimentos para o isolamento de
linfócitos B, sendo que os mais utilizados são:
a. Através da observação empírica, notou-se que os linfócitos B têm a
tendência de se aderir às superfícies sólidas, enquanto que os
linfócitos T são relativamente não aderentes. Com isso, o uso da
técnica de aderência em lã de nylon ainda pode ser usado por alguns
laboratórios, sendo que a viabilidade em células não frescas é bem
baixa, dificultando no processo de tipagem de classe II.
b. Através do processo onde pérolas imunomagnetizadas se ligam aos
linfócitos (T ou B) e, dessa forma, através da atração magnética esses
7
linfócitos são isolados das demais células presentes na amostra.
(FluoroBeads específicas para linfócito T ou B).
Seguem explicações mais detalhadas sobre as técnicas a seguir:
Detalhes de Cada Técnica
1. Microtécnica do Canudo com Lã de Nylon - as proporções dadas abaixo
são para coluna capaz de manusear até 10 x 106 células/mL:
a. Feche uma das saídas de um canudo plástico, flexível e transparente
(0,6 x 12-14 cm) em ângulo de 45°;
b. Proceda com um bom retalhamento de 0,1g de lã de nylon esfregado,
encharcando-o em HBSS ou PBS em uma placa de Petri;
c.
Encha ¾ do canudo com HBSS ou PBS. Então, usando a ponteira de
uma pipeta, gradualmente e uniformemente, coloque a lã de nylon
dentro do canudo para uma altura de aproximadamente 6 cm. Nesse
estágio a coluna pode ser armazenada a 4°C por até 2 semanas;
d. Corte ou perfure o lado selado do canudo fazendo uma abertura de
aproximadamente 2 mm;
e. Lave a lã de nylon com 5 mL HBSS ou PBS e então com 5 mL de meio
contendo HIFCS a 5%;
f.
Quando o meio cobrir a lã de nylon, gire o canudo para a posição
horizontal e incube por 30 min a 37°C. Alternativamente, use meio
pré-aquecido (morno);
g. Adicione 0,5 mL de suspensão de linfócitos purificados (procedimento
descrito acima) em HIFCS a 5% ao topo da coluna e permita às
células se moverem por todo o percurso dentro da lã. Uma boa
separação de células T e B depende da pureza da preparação de
linfócitos iniciais, portanto, a suspensão deverá ser isenta de
granulócitos e plaquetas;
h. Adicione aproximadamente 0,2 mL de HIFCS a 5% ao topo da coluna
para prevenir ressecamento. Deixe a coluna deitada e incube a 37°C
por 30 min;
i.
Para recuperar os linfócitos T, realize duas lavagens (8 mL cada) com
HIFCS a 5% morno (37°C) gotejando através da coluna que deverá
estar na posição vertical. O eluente contém células T não aderentes;
8
j.
Para recuperar as células B aderentes, adicione 1,5 mL de HIFCS a
5% à coluna e, repetidamente, esprema o canudo. Continue essa
etapa até que 8 mL do meio tenham sido usados;
k.
Centrifugue ambas as suspensões de células T e B por 5 min a 1000 x
g e lave-as uma vez com 1 mL de HIFCS a 5%;
l.
Ressuspenda as células em quantidade mínima de meio (ex. 0,5 mL),
verifique a viabilidade, conte as células e ajuste a concentração para
2x106 células/mL;
m. Na média, esse procedimento deverá fornecer uma recuperação de
80-90% das células.
2. Isolamento de Linfócitos B (Puros) Através de Pérolas Imunomagnetizadas
– Fluorobeads B (One Lambda, Inc.):
Este procedimento leva menos de 10 minutos para ser completado e
é realizado totalmente em temperatura ambiente. O reagente de separação
Fluorobeads B é composto de partículas imunomagnéticas acopladas a
anticorpo monoclonal (CD19) específico para o linfócito B. Essas pérolas se
ligam seletivamente aos linfócitos B e, então, são isoladas com o auxílio de
um magneto (FBAMAG6 + 6 – One Lambda, Inc.).
3. Isolamento a Partir de Sangue Total:
a. Dispense 5 mL de sangue em um tubo de 15 mL.
b. Adicione 5 mL de PBS/Citrato 1X e misture por inversão.
c.
Antes do uso, ressuspenda completamente as FluoroBeads B. Agite
em Vortex por 10 segundos.
d. Adicione 100 µL de FluoroBeads T à amostra de teste. Tampe
imediatamente o tubo e o inverta por 2-3 minutos para dispersar as
pérolas magnéticas.
e. Agite delicadamente o tubo através de rotação por 5 minutos à
temperatura de 22-25°C para permitir que as pérolas se liguem às
células B (não exceder 5 minutos). Pode ser usada rotação manual ou
mecânica.
f.
Destampe o tubo e coloque-o em um separador magnético por 5
minutos. Remova e descarte o sobrenadante com uma pipeta
descartável. Então, remova tubo do magneto.
9
g. Adicione 2-3 mL de PBS/Citrato 1X (PC1-500). Agite o tubo para a
ressuspensão das pérolas.
h. Destampe o tubo e coloque-o em separador magnético por 1 minuto.
i.
Remova e descarte o sobrenadante com uma pipeta descartável.
Então, remova o tubo do magneto.
j.
Repita essa etapa de lavagem somente com o PBS/Citrato 1X outras
duas vezes.
k.
Siga com os procedimentos de identificação e marcação da célula
conforme descrito a seguir, ou ressuspenda as células (beads) em 0,5
mL de meio McCoy ou equivalente, com 5% HIFCS.
Procedimento de Marcação e Concentração da Célula
A. Pelo método CFDA:
1. Destampe e coloque o tubo em um separador magnético por 1
minuto. Remova o sobrenadante. Ressuspenda as células (beads)
com PBS. Repita essa etapa duas vezes.
2. Adicione 0,5 mL de CFDA (solução de trabalho, pH 5,5) e misture.
3. Incube o tubo horizontalmente no escuro por 10 minutos a 20-25°C.
4. Repetir etapa 1.
5. Ressuspenda as células em 0,5 mL de meio McCoy ou equivalente,
com 5% HIFCS.
6. Adicione 1 µL de suspensão celular a um poço branco de uma placa
Terasaki. Verifique a contagem de células através de um microscópio
de fluorescência. Ajuste a concentração para 2 x 106/mL (2.000
células por poço).
7. As amostras poderão ser transferidas para tubos de 1,5 mL e
armazenadas horizontalmente a 2-5°C por até 2 dias antes de serem
aplicadas nas placas para o teste.
B. Método do FQAE – FluoroQuench (corante) com Brometo de etídeo e
Laranja de acridina:
1. Transfira 1 µL de células (beads/pérolas) para um poço branco de
uma placa Terasaki.
2. Adicione 5 µL de FQAE (cat. OLI # FQAE-500) ao poço.
10
3. Verifique a contagem da célula através de um microscópio de
fluorescência. Ajuste, remova e descarte o sobrenadante com uma
pipeta descartável. Então, remova o tubo do magneto.
4. As amostras poderão ser transferidas para tubos de 1,5 mL e
armazenadas horizontalmente a 2-5°C por até dois dias antes de
serem aplicadas nas placas para o teste.
Após esse procedimento, teremos células B prontas para tipagem
HLA de classe II.
Observação: o protocolo a seguir é um protocolo recomendado, partindo-se
do pressuposto de que o laboratório estará utilizando a metodologia do
FQAE como corante das células. Os tempos de incubação podem variar
dependendo da força de tipagem dos reagentes e/ou complemento
utilizado. (A One Lambda sugere 30 minutos com o anticorpo e 60 minutos
com o complemento, nas placas de tipagem de HLA).
Procedendo Com o Teste
Devido à resistência de cada reagente, tome os cuidados necessários
quando dispensar as células e os reagentes. Não toque o fundo dos poços
com as agulhas das seringas.
Descongele as placas à temperatura ambiente (20-25°C) por 15
minutos e use-as em até 1 hora após a retirada do freezer. Agite o tubo
contendo sua amostra por inversão – não agite através do procedimento de
pipetagem repetitiva.
1. Para cada poço adicione 1 µL de uma suspensão de linfócitos B (2 x
106 células/mL) para as placas de tipagem HLA, usando uma seringa
de 50 µL conectada a um dispensador de repetição.
2. Misture as micro-gotas, usando um misturador eletrostático ou um
arame.
3. Incube as placas à temperatura ambiente (20 a 25°C) por 60
minutos para as placas monoclonais e avance para a etapa # 6.
 Para placas com alosoro, incube por 30 minutos a 20-25°C.
4. Adicione 5 µL de complemento DR (CDR-5, CDR-50 ou CDR1D) a
cada poço da placa com alosoro. Incube por 1 hora no escuro.
11
Observação: Placas Monoclonais (LMT ou SMT): Não é necessária esta etapa
de adição de complemento de coelho e esse período de incubação. Da
etapa (4) avance diretamente para a etapa (6).
5. Em cada poço adicione 5 µL de FQAE.
6. As placas podem ser lidas de imediato ou então poderão ser
armazenadas a 2-5°C por até dois dias.
Célula morta ocorrerá em qualquer poço teste onde o antígeno HLA
na superfície da célula é reconhecido pelo seu anticorpo anti-HLA
conjugado. Para teste de fluorescência, os linfócitos negativos (vivos)
aparecem verdes, e os linfócitos positivos (mortos) aparecem vermelhos
(quando usando corante fluorescente da One Lambda com laranja de
acridina e brometo de etídio – FQAE-500).
Avaliação Microscópica dos Testes
A contagem da reação é feita pela estimativa de percentual de células
mortas. Se houver linfócitos mortos no controle negativo, o percentual de
células mortas nos poços restantes deve ser ajustado de acordo. O padrão
ASHI de leitura é:
Score
% de células mortas
Interpretação
1
0 - 10 %
Negativo
2
11 - 20 %
Negativo duvidoso
4
21 - 50 %
Positivo fraco
6
51 - 80 %
Positivo
8
81 - 100 %
Fortemente positivo
0
-------
Ilegível
As frequências fenotípicas para HLA de classe I variarão de modo
diferente nas diferentes populações (caucasoides, negroides, orientais,
etc.). Referência 4.
CALIBRAÇÃO DO PROCESSO
Não existe procedimento de calibração para a metodologia em
questão.
12
CÁLCULOS E OBTENÇÃO DOS RESULTADOS
Não existe cálculo para a obtenção dos resultados da medição. O
resultado é feito pelo “score” da reação pela estimativa de percentual de
células mortas realizada pela leitura microscópica.
LIMITAÇÕES DO PROCESSO
Dificuldades na separação celular e contaminação da preparação de
linfócitos com células vermelhas, leveduras, monócitos, plaquetas ou
granulócitos podem causar resultados errôneos.
Cabe, ainda, salientar que resultados errôneos podem ocorrer quando
concentrações de células estão acima ou abaixo do nível aceitável. A
contaminação
bacteriológica
ou
a
mudança
no
pH
de
reagentes
monoclonais podem causar reações falso negativas.
Certos antígenos HLA frequentemente exibem especificidades fracas.
Estes são chamados antígenos de reação cruzada e são detalhados por
antígenos e anticorpos de cada placa na folha guia de reação modelo que
acompanha a placa.
CONTROLE INTERNO DE QUALIDADE
Uma amostra com tipagem previamente conhecida deverá ser
utilizado anterior ao início dos testes de rotina para averiguar a
confiabilidade do novo lote de placa recebido no laboratório. Somente
utilizar as placas dentro de seu prazo de validade.
Caso o laboratório queira testar a pureza de suas preparações
celulares
ou
ainda
em
combinação
identificar
a
contaminação
da
preparação de células, os Controles da One Lambda poderão ser utilizados
conforme explicados abaixo:

NS = O soro controle normal é usado para determinar o fundo
de células mortas. Esse soro é proveniente de soro humano do
sexo masculino que não tenha sofrido transfusão com sangue
AB negativo.
13

ABSM, ABSG, ABSMD = Os controles antilinfócitos B são usados
para determinar a pureza dos linfócitos B. Os controles
antilinfócitos B são anticorpos monoclonais os quais são
fortemente citotóxicos aos linfócitos B sem reatividade contra
granulócitos, linfócitos T, plaquetas, monócitos e células
vermelhas do sangue teste. (OBS.: O ABSG, na diluição de
trabalho fornecida, não é recomendado para o teste de células
com leucemia crônica linfocitária, nas placas LCT30D da One
Lambda.)

AGSM, AGSMD = Os controles antigranulócitos são utilizados
para determinar a pureza dos granulócitos. Esses controles são
anticorpos monoclonais os quais são fortemente citotóxicos
aos granulócitos, mas sem reatividade contra linfócitos B,
linfócitos T, plaquetas, monócitos e células vermelhas do
sangue teste.

AMSM, AMSMD = Controles antimonócitos são usados para
determinar a pureza de monócitos. Os controles antimonócitos
são
anticorpos
citotóxicos
a
monoclonais
monócitos,
os
mas
quais
sem
são
fortemente
reatividade
contra
granulócitos, linfócitos B, linfócitos T, plaquetas e células
vermelhas do sangue teste.

ATSG, ATSM, ATSMX, ATSMD = Controles antilinfócitos T que
são utilizados para determinar a pureza de linfócitos T. Os
controles antilinfócitos T são anticorpos monoclonais os quais
são fortemente citotóxicos a linfócitos T, mas sem reatividade
contra granulócitos, linfócitos B, plaquetas, monócitos e células
vermelhas do sangue teste. OBS.: O ATSMX é o único controle
anti-T para ser utilizado com células isoladas com FluoroBeads
T.

ALSG, ALSM = Controle antilinfócitos totais são usados para
determinar a reatividade do complemento. Esse controle é
feito com anticorpos monoclonais
os quais são fortemente
citotóxicos aos linfócitos humanos. OBS.: não utilize ALSG
como controle para teste com DTT (Ditiotreitol), pois o DTT irá
degradá-lo.
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VALORES DE REFERÊNCIA OBTIDOS EM POPULAÇÕES SADIAS OU VALORES
DEMOGRÁFICOS,
EPIDEMIOLÓGICOS,
ESTATÍSTICOS,
DESEJÁVEIS,
TERAPÊUTICOS OU TÓXICOS
Estes dados não estão disponíveis para a metodologia em questão.
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO
A. Potência e especificidade:
Os reagentes-teste foram precisamente caracterizados por triagens
sequenciais sorológicas separadas. Os painéis de amostras de referência de
linfócitos congelados foram usados em duas triagens separadas.
Dois terços de todos os reagentes selecionados são fortes, com
reatividade HLA específica claramente definida (com 70% de índice de
força), permitindo não mais que 10% de reações falso positivas e 15% de
reações falso negativas. O restante - um terço de reagentes - não foram de
encontro com esse critério, mas foram exaustivamente investigados quanto
à sua utilidade quando usados para sustentar outros anticorpos bemdefinidos.
Anticorpos multiespecíficos foram usados somente se anticorpos não
monoespecíficos são disponíveis para uma especificidade em particular.
Anticorpos multiespecíficos foram escolhidos com o mesmo desempenho
característico
para
todas
as
especificidades
como
o
anticorpo
monoespecífico. A triagem contra um painel de linfócitos frescos preparados
foi utilizada para confirmar e validar a força do soro e sua especificidade.
As análises foram feitas usando técnicas computadas no Eighth
International Histocompatibility Workshop em 1980. (referência 4).
B. Controle Negativo
O antissoro do controle negativo é originário de um sangue saudável
humano masculino do tipo AB, o qual não possui reatividade citotóxica em
testes com doadores de linfócitos selecionados ao acaso. Esse controle é
usado para determinar a viabilidade do linfócito.
15
C. Controle Positivo:
O controle positivo é um anticorpo monoclonal com ação fortemente
citotóxica aos linfócitos humanos. Esse controle é usado para determinar a
atividade de complemento.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
TERASAKI PI, BERNOCO F., PARK MS, OZTURK G, IWAKI Y. Microdroplet testing for
HLA A, B, C and D antigens. Am J. Clin Pathol 69:103-120, 1978.
DANILOVS J, TERASAKI PI, PARK MS, AYOUB G. B lymphocyte isolation by thrombin
nylon wool. In Histocompatibility Testing. Terasaki PI, Ed., UCLA Tissue Typing
Laboratory, Los Angeles, CA 287-288, 1980.
ASHI Laboratory Manual, 2nd ed. Edited by Zachary, Andrea A. and Teresi, Gary, p.
199, 1990.
TERASAKI PI, Ed., Histocompatibility Testing. Los Angeles, CA, 1980.
NIKAEIN A, Ed., ASHI Procedure Manual, 3rd Edition, ASHI, Lenexa, KS.
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One Lambda, Inc.
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REGISTRO ANVISA NÚMERO
80298490001
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RESPONSÁVEL TÉCNICA
Edna Cristina Kurokawa Guimarães Ferreira
CRQ/PR: 09302336
REVISÕES
Revisão
Descrição da Alteração
Data
00
Elaboração
Formatação, layout, produtos
descontinuados, alteração nas condições
de armazenagem e transporte, inclusão
das denominações comerciais de cada
item da família, inclusão de número de
registro e alteração de Responsável
Técnica
Alteração do DDG
Revisão ortográfica e gramatical,
formatação, alteração de Responsável
Técnica
09/2006
01
02
03
02/2011
09/2012
12/2012
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