Atividade anti-helmíntica de Azadirachta indica A. Juss sobre

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ - UECE
FACULDADE DE VETERINÁRIA - FAVET
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
VETERINÁRIAS - PPGCV
Cícero Temístocles Coutinho Costa
ATIVIDADE ANTI-HELMÍNTICA DE Azadirachta indica A. Juss
SOBRE NEMATÓIDES GASTRINTESTINAIS DE OVINOS
Fortaleza - Ceará
Dezembro de 2004
1
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
ATIVIDADE ANTI-HELMÍNTICA DE Azadirachta indica A. Juss SOBRE
NEMATÓIDES GASTRINTESTINAIS DE OVINOS
Fortaleza, CE
Dezembro de 2004
2
Universidade Estadual do Ceará
Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa
Faculdade de Veterinária
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
Cícero Temístocles Coutinho Costa
ATIVIDADE ANTI-HELMÍNTICA DE Azadirachta indica A. Juss SOBRE
NEMATÓIDES GASTRINTESTINAIS DE OVINOS
Dissertação apresentada ao programa de PósGraduação
Faculdade
em
de
Ciências
Veterinária
Veterinárias
da
da
Universidade
Estadual do Ceará, como requisito parcial para a
obtenção do grau de mestre em Ciências
Veterinárias.
Área de concentração: Reprodução e Sanidade
Animal
Orientador(a): Dra. Claudia Maria Leal Bevilaqua
Fortaleza, Ceará
Dezembro de 2004
3
Universidade Estadual do Ceará
Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa
Faculdade de Veterinária
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
Título do Trabalho: ATIVIDADE ANTI-HELMÍNTICA DE Azadirachta indica
SOBRE NEMATÓIDES GASTRINTESTINAIS DE OVINOS
Autor: Cícero Temístocles Coutinho Costa
Aprovada em _____/_____/____
Banca Examinadora:
____________________________
Profa. Dra. Claudia Maria Leal Bevilaqua
Orientadora
_____________________________
Dr. Luiz da Silva Vieira
Examinador
________________________
Dra. Mariângela Valente
Examinadora
4
C837a
Costa, Cícero Temístocles Coutinho
Atividade anti-helmíntica de Azadirachta indica A. Juss sobre
nematóides gastrintestinais de ovinos /
Cícero Temístocles Coutinho Costa.
2004.
60p.
Orientadora: Profa Dra. Claudia Maria Leal Bevilaqua
Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias)
Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária.
-
1. Parasitologia 2. Azadirachta indica 3. Nematóides gastrintestinais
4. Haemonchus contortus
I.Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária.
CDD: 574
5
Á minha família cujo esforço possibilitou a minha
formação profissional;
À minha namorada pelo apoio e amor incondicional
Dedico
6
AGRADECIMENTOS
A Deus por ter me guiado e dado forças por mais esta etapa da minha vida
Á professora Dra. Claudia Maria Leal Bevilaqua por sua orientação e
dedicação, requisitos fundamentais para a realização desse trabalho.
Á professora Dra Selene Maia de Morais por sua ajuda, dedicação e
colaboração com seus ensinamentos que foram importantes para a realização deste
trabalho.
Á Cristiane cuja ajuda foi de fundamental importância para a realização desse
trabalho.
A todos os colegas do Laboratório de Doenças Parasitárias do PPGCV, que
me ajudaram na realização deste projeto e estiveram ao meu lado durante este
período, em especial Iarle, Lucilene, Ana Lourdes, Michelline, Ana Carolina, Iara,
Fernanda Menezes
Aos estagiários do Laboratório de Parasitologia da UFC pela atenção e
colaboração, especialmente Fernanda, Rafaela, Daniele.
À Ms Marta Maria Caetano de Souza por sua amizade e ajuda na realização dos
experimentos.
À Professora Mariângela por sua amizade, ensinamentos e contribuição para a
realização do projeto.
7
Ao Professor Neuman que gentilmente cedeu as instalações da fazenda de
Pentecostes.
A todos os colegas do mestrado em Ciências Veterinárias do PPGCV, que
fizeram parte dessa caminhada de dois anos, passando juntos por mais uma etapa no
caminho da nossa realização profissional.
A Alzenira e Adriana Albuquerque, secretárias do PPGCV, que em muito me
ajudaram durante todo o tempo do mestrado.
A CAPES pelo apoio financeiro durante estes dois anos de trabalho
À minha família que sempre me apoiou, principalmente nos momentos difíceis
da realização deste trabalho, em especial a meu pai Francisco Sérgio Costa e
minha mãe Maria Irma Coutinho Costa, exemplo de dedicação.
A minha namorada, Maria Vivina Barros Monteiro pela confiança em mim
depositada e por ter sempre procurado estar presente com seus cuidados, carinhos e
incentivo. Te agradeço com todo meu respeito, admiração e amor.
As demais pessoas que não foram aqui mencionadas, mas que contribuíram para
a concretização deste trabalho.
8
RESUMO
O controle de nematóides é realizado com anti-helmínticos, porém o
desenvolvimento de cepas resistentes tem exigido a pesquisa de novas alternativas.
Existem relatos populares sobre a atividade antiparasitária de Azadirachta indica. O
objetivo do presente trabalho foi avaliar a atividade anti-helmíntica in vitro e in vivo de A.
indica. No teste in vitro foram avaliados os extratos acetato de etila e etanólico de folhas
de A. indica nas concentrações de 50; 25; 12,5; 6,25 e 3,12 mg mL-1sobre ovos e larvas de
Haemonchus contortus. No teste in vivo foram utilizados 40 ovinos divididos em quatro
grupos, durante 3 meses. O grupo I foi tratado com folhas secas de A. indica, misturadas ao
concentrado, na dose de 0,1g/kg. O grupo II foi tratado com o dobro da dose do grupo I. O
grupo III recebeu Diantel na dose recomendada pelo fabricante e o grupo IV não foi
tratado. Para comparar os efeitos do tratamento, foram avaliados os seguintes parâmetros:
contagem de ovos nas fezes (OPG), carga parasitária, peso e hematócrito. Os resultados do
teste in vitro, do hematócrito, assim como do desenvolvimento ponderal dos animais foram
submetidos a ANOVA, e teste Tukey a 5% de probabilidade. Os resultados da carga
parasitária e do OPG foram avaliados pelo teste de Kruskal Wallis. O extrato etanólico
inibiu 98,2% da eclosão de ovos na concentração de 3,1 mg mL-1 e 87,1% do
desenvolvimento larval na concentração de 50 mg mL-1. Verificou-se no teste in vivo que
não houve diferença significativa entre os parâmetros avaliados quando comparado ao
grupo controle, demonstrando que, no protocolo utilizado, A. indica não apresentou efeito
anti-helmíntico. Os resultados sugerem que são necessários outros testes in vivo com o
extrato etanólico de A. indica, para se comprovar a eficácia anti-helmíntica.
9
Abstract
Gastrointestinal nematodes control have been realized by utilization of
anthelmintics, but the resistance development by this parasites has required research of
control alternatives. There are popular reports about Azadirachta indica antiparasitic
activity. For these reasons, the aim of this study was to evaluate the in vitro and in vivo
anthelmintic activity of Azadirachta indica. In in vitro test the ethyl acetate and ethanol
extracts of Azadirachta indica were tested on Haemonchus contortus eggs and larvae. The
extracts were evaluated at five concentrations: 3.1, 6.2, 12.5, 25.0 and 50.0 mg mL-1.In in
vivo test, were used 40 sheep separated in four groups of treatment, during three months.
The group I was treated with A. indica dry leaf, mixed in concentrade at 0,1 g/kg dose;
group II was treated with double group I dose; group III was treated with Diantel in
manufacturer recommended dose and group IV didn’t was treated. In all groups to compare
the treatments effects, it were evaluate these following parameters: eggs counts per gram of
faeces (EPG), parasitic burdens, weight and haematocrit. The in vitro tests, haematocrit
results, as well as animals ponderal development were submitted to analisis of variance
(ANOVA) and Tukey test with 5% of probability. Parasitic burdens and EPG results, were
evaluated by Kruskall Wallis test. The ethanol extract inhibited 98.2% of the egg hatching
at 3.1 mg mL-1 and 87.1% of the larval development at 50 mg mL-1 Evaluated parameters,
in vivo tests didn’t were difference statistical when compared to control group,
demonstrating that, in this protocol used, A. indica didn’t posses anthelmintic effect. The
results suggest another in vivo tests with the A. indica ethanol extract to descovery a
anthelmintic activy.
10
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS------------------------------------------------------------------------
12
LISTA DE FIGURAS-------------------------------------------------------------------------
13
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS-------------------------------------------
14
1) INTRODUÇÃO-----------------------------------------------------------------------------
15
2) REVISÃO DE LITERATURA ----------------------------------------------------------
16
2.1) Anti-helmínticos ---------------------------------------------------------------------
16
2.2) Resistência anti-helmíntica----------------------------------------------------------
16
2.3) Testes de avaliação anti-helmíntica------------------------------------------------
17
2.4) Plantas Medicinais--------------------------------------------------------------------
18
2.4.1) Generalidades----------------------------------------------------------------------
18
2.4.2) Plantas Medicinais com atividade anti-helmíntica na Veterinária----------
21
2.4.3.) Azadirachta indica---------------------------------------------------------------
22
2.4.3.1)Considerações Gerais-----------------------------------------------------------
22
2.4.3.2) Composição Química----------------------------------------------------------
23
2.4.3.3) Mecanismos de ação------------------------------------------------------------
23
2.4.3.4) Potencial uso da planta---------------------------------------------------------
24
3) JUSTIFICATIVA---------------------------------------------------------------------------
27
4) OBJETIVOS---------------------------------------------------------------------------------
28
5) METODOLOGIA--------------------------------------------------------------------------
29
5.1)Teste in vitro----------------------------------------------------------------------------
29
5.1.1) Preparação dos extratos---------------------------------------------------------
29
5.1.2) Obtenção de ovos e larvas------------------------------------------------------
29
5.1.3) Teste de eclosão de ovos (TEO) ----------------------------------------------
29
5.1.4) Teste de desenvolvimento larval (TDL) -------------------------------------
30
5.1.5) Estudo Fitoquímico--------------------------------------------------------------
30
5.1.6) Análise Estatística---------------------------------------------------------------
30
5.2)Teste in vivo-----------------------------------------------------------------------------
30
5.2.1) Desenho Experimental---------------------------------------------------------
30
5.2.2) Exames de Sangue e Coprológico--------------------------------------------
31
5.2.3) Procedimento de Necrópsia---------------------------------------------------
31
5.2.4) Análise Estatística--------------------------------------------------------------
31
11
6) RESULTADOS ----------------------------------------------------------------------------
32
7) DISCUSSÃO --------------------------------------------------------------------------------
37
8) CONCLUSÕES-----------------------------------------------------------------------------
40
9) PERSPECTIVAS---------------------------------------------------------------------------
41
10) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS------------------------------------------------
42
11) ANEXOS-----------------------------------------------------------------------------------
51
ANEXO I - ATIVIDADE OVICIDA E LARVICIDA DE EXTRATOS DE
Azadirachta indica A. Juss SOBRE Haemonchus contortus
12
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Percentual de eficácia média (± EP) dos extratos acetato de etila e etanólico de A.
33
indica sobre a inibição da eclosão de ovos de H. contortus
Tabela 2: Percentual de eficácia média (± EP) dos extratos acetato de etila e etanólico de A.
33
indica sobre a inibição do desenvolvimento das larvas de H. contortus.
Tabela 3 Média (± DP) da contagem de ovos nas fezes (OPG) para os grupos de ovinos
34
tratados com Azadirachta indica e controles durante 90 dias.
Tabela 4. Média (± DP) de nematóides adultos recuperados do trato digestivo de ovinos
35
tratados com Azadirachta indica e respectivos grupos controle.
Tabela 5 Ganho de peso médio ± desvio padrão de ovinos tratados com Azadirachta indica
aos 90 dias de tratamento e controles.
36
13
LISTA DE FIGURAS
FIGURA. 1 Flores e folhas de Azadirachta indica
22
FIGURA 2 Folhas e frutos de Azadirachta indica
22
FIGURA 3 Percentagem média do hematócrito entre os grupos tratados com Azadirachta
36
indica e controles durante o período experimental.
14
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
dp – Desvio padrão
ep – Erro padrão
Ht – Hematócrito
kg - Quilograma
mL – Mililitro
mg - Miligrama
µl - Microlitro
OPG – Ovos por grama de fezes
TEO – Teste de Eclosão de Ovos
TDL – Teste de Desenvolvimento Larvar
V/V – Volume por Volume
15
1. Introdução
A
ovinocaprinocultura
desempenha
importante
papel
sócio-econômico,
principalmente para os pequenos produtores rurais, que têm a partir desses animais fonte
de proteína e renda. Contudo, a eficiência produtiva desses animais é limitada, devido a
problemas sanitários e nutricionais (PINHEIRO et. al., 2000).
O parasitismo por nematóides gastrintestinais é uma das principais causas de
mortalidade de ovinos e caprinos no nordeste brasileiro (VIEIRA et al., 1997). Dentre os
parasitos gastrintestinais, o nematóide Haemonchus contortus ocupa lugar de destaque
devido a sua alta patogenicidade, sendo responsável por acentuadas perdas econômicas,
decorrentes da diminuição da produtividade e mortalidade dos animais, particularmente
dos jovens (UENO E GONÇALVES, 1998). Diante disso, a aplicação de medidas de
controle das verminoses é essencial para o sucesso da produção de ruminantes. Esse
controle é realizado, principalmente, com anti-helmínticos que visam reduzir os níveis de
infecção dos animais e promover a descontaminação das pastagens (CHARLES, 1995).
No tocante a aplicação de anti-helmínticos, seu uso inadequado e contínuo resultou
no desenvolvimento de cepas resistentes a esses fármacos (COLES et al., 1992). São
inúmeros os relatos de nematóides resistentes à várias classes de anti-helmínticos
(JACKSON, 1993; MELO et al., 1998). Além da resistência, as drogas disponíveis no
comércio possuem desvantagens como alto custo, poluição ambiental e resíduo alimentar
(WALLER, et al., 1995; HERD, 1996). Considerando esses problemas, alternativas como
a fitoterapia podem ser utilizadas para reduzir o uso desses fármacos. (VIEIRA et al.,
1999).
A validação científica dos fitoterápicos é uma etapa obrigatória para a utilização
correta das plantas medicinais para fins comerciais. Os testes in vitro e in vivo utilizandose partes da planta ou até mesmo compostos químicos extraídos a partir delas, permitem
avaliar uma possível propriedade anti-helmíntica, determinando, portanto, o primeiro passo
para a caracterização de substâncias ativas da planta, abrindo novas possibilidades para o
controle das endoparasitoses, o que permitirá otimizar a eficiência produtiva não só destes
animais como também de outras espécies domésticas.
16
2. Revisão de Literatura
2.1 Anti-helmínticos
O controle de helmintos em animais domésticos é amplamente baseado no
emprego de drogas anti-helmínticas (CHARLES et al, 1989). O anti-helmíntico ideal
deveria eliminar adultos e estádios imaturos de helmintos sem produzir efeitos tóxicos nos
hospedeiros, possuir um curto período de carência, ser inócuo ao meio ambiente e de baixo
custo (ECHEVARRIA, 1996).
O fato do anti-helmíntico ser tóxico somente para o parasito, sem afetar a função
celular do hospedeiro, constitui-se um grande desafio na busca de novos compostos
(PRICHARD, 1985).
Os compostos anti-helmínticos atualmente disponíveis exercem seus efeitos sobre o
parasito através da dinâmica microtubular, coordenação neuromuscular e nos processos de
metabolismo energético. Os locais específicos de interferência com o metabolismo
energético incluem o transporte de glicose até o citosol do parasito, a atividade de enzimas
mitocondriais, tais como a fumarato redutase e a fosforilação oxidativa de ADP em ATP.
Os locais específicos de modificação na atividade neuromuscular no parasito incluem a
enzima acetilcolinesteras e receptores neurais (LANUSSE, 1996).
Deve-se ressaltar que há registros do desenvolvimento de resistência dos parasitos a
todas as classes de anti-helmínticos atualmente utilizadas (PRICHARD, 1990).
2.2. Resistência anti-helmíntica
Resistência parasitária aos anti-helmínticos é um fenômeno pelo qual alguns
organismos de uma população são capazes de sobreviver após constante utilização de um
composto químico. O diagnóstico será positivo para “resistência” quando uma determinada
droga que apresentava redução acima de 99% da carga parasitária obtiver redução menor
que 95% contra um determinado organismo após certo período de tempo (MOLENTO,
2004).
O desenvolvimento da resistência é uma conseqüência inevitável do uso de antihelmínticos (WALLER, 1993). A situação é mais severa em nematóides de ovinos e
17
caprinos (VIEIRA et al., 1992; VAN WYK, 1997; MELO et al., 1998; CRAVEN, 1999;
ANDREWS, 2000; ZAJAC & GIPSON, 2000). Os primeiros relatos de resistência aos
anti-helmínticos usados para o controle de nematóides de ovinos ocorreram com o
tiabendazol, após poucos anos de sua introdução no mercado (DRUDGE et al., 1964 apud
MELO e BEVILAQUA, 2002). Esse problema espalhou-se pelo mundo inteiro e ocorre
geralmente em áreas com verões chuvosos e onde o parasito H. contortus é endêmico,
principalmente Austrália, África do Sul e América do Sul (WALLER et al., 1995; CRAIG,
1993).
A resistência ocorre devido à existência de parasitos que possuem características
biológicas que lhes conferem resistência aos efeitos tóxicos dos anti-helmínticos. Essas
características, por sua vez, são determinadas por genes que podem ser transmitidas a
progênie e, portanto, um tratamento repetido pode selecionar aumentando a população de
indivíduos resistentes (PRICHARD, 1990). Há três fases no processo de seleção. A
primeira consiste em uma fase inicial em que o anti-helmíntico é utilizado em uma
população cuja freqüência de indivíduos resistentes é baixa. Com a exposição contínua ao
fármaco, uma fase intermediária se desenvolve com o aumento da freqüência das formas
heterozigóticas. Com a manutenção da pressäo de seleção, haverá a terceira fase em que os
indivíduos homozigotos resistentes ao fármaco utilizado prevalecerão na população.
A seleção para resistência é aumentada pelo alto potencial biótico dos nematóides
gastrintestinais, especialmente H. contortus. Isso ocorre porque a elevada fecundidade
aumenta significativamente pequenas populações resistentes em um curto espaço de
tempo, principalmente se as condições ecológicas forem favoráveis aos estágios de vida
livre (CRAIG, 1993).
O manejo, em especial a utilização errônea de anti-helmínticos, contribui para o
aumento da pressão de seleção e conseqüentemente da resistência (CRAIG, 1993;
MOLENTO, 2004). Pode-se citar como utilização errônea a subdosagem (MOLENTO,
2004), o curto espaço de tempo entre as administrações de anti-helmínticos e a baixa ou
alta rotação de princípios ativos (BARNES e DOBSON, 1990).
2.3. Testes de avaliação anti-helmíntica
Para verificar a eficácia anti-helmíntica, e desta forma avaliar o grau de resistência
de nematóides gastrintestinais, utilizam-se testes in vivo e in vitro.
18
Os testes in vivo avaliam a eficácia anti-helmíntica através da avaliação da redução
da contagem de ovos nas fezes (FECRT). Este teste envolve o tratamento de animais
naturalmente infectados e pode ser utilizado em ruminantes, eqüinos e suínos, avaliando
todos os tipos de anti-helmínticos e com todas as espécies de nematóides em que os ovos
são expelidos pelas fezes. O teste fornece uma estimativa da eficácia anti-helmíntica
através da comparação da contagem de ovos dos nematóides adultos antes e após o
tratamento. A contagem de ovos nas fezes de animais do grupo não tratado fornece uma
medida de mudança que pode ocorrer durante o período do teste (COLES et al., 1992).
Os testes in vitro se constituem na observação da ação do fármaco pelo contato
direto com os estágios de ovo ou larva do parasito para avaliar seu efeito sobre a eclosão
de ovos e desenvolvimento ou motilidade de larvas. O teste de eclosão de ovos se baseia na
capacidade dos benzimidazóis, mais especificamente o tiabendazol, de inibir o
desenvolvimento e conseqüentemente a eclosão de ovos de nematóides frescos, isolados a
partir de um processo de passagem em tamises com abertura entre malhas decrescente
(HUBERT & KERBOEUF, 1992). A partir dos resultados obtidos no teste calcula-se a
dose efetiva para inibir a eclosão de 50% dos ovos (DL50). As vantagens deste teste se
concentram na rapidez, simplicidade e baixo custo. Porém não consegue detectar
resistência abaixo de 25% para Trichostrongylus colubriformis e de 50% para Ostertagia
circuncicta (VÁRADY & CORBA, 1999). Outra desvantagem é a não identificação dos
nematóides resistentes, por causa da similaridade em tamanho e aparência dos ovos de
diversos gêneros de nematódeos (ECHEVARRIA, 1996).
O teste de desenvolvimento larvar se constitui na inibição do crescimento de larvas
de primeiro e segundo estágio ao terceiro. A vantagem desse teste é a possibilidade de
medir a eficácia, simultaneamente, de vários anti-helmínticos diferentes, além de
possibilitar a diferenciação das espécies resistentes aos anti-helmínticos (COLES et al.,
1992). Segundo COLES et al. (1992) os métodos de LACEY (1991) e HUBERT &
KERBOEUF (1992) são os testes mais recomendáveis, já que mostraram boa correlação
com o percentual de eficácia dos testes in vivo. O teste de motilidade larvar tem
demonstrado ser um teste com resultados controversos. ECHEVARRIA (1996) e
VÁRADY & CORBA (1999) observaram resultados discordantes sugerindo que o teste
seja subjetivo, quanto a classificação de uma larva está paralisada ou não. Porém GEERTS
et al. (1989) não observaram diferença entre seus achados e a literatura disponível, além de
19
não terem encontrado influência na manipulação dos operadores, tempo de incubação,
temperatura e o tempo de observação.
Atualmente estes testes além de verificarem a ação de anti-helmínticos sintéticos,
tem sido utilizados para avaliação preliminar ou triagem de plantas com atividade ovicida
ou larvicida (BATISTA, 1999; ATHANASIADOU et al., 2001; PESSOA et al, 2002;
COSTA et al, 2002; ASSIS et al., 2003).
.
2.4 Plantas Medicinais
2.4.1. Generalidades
Desde o início da civilização o homem usa produtos de origem animal, vegetal, e
mineral como fonte de princípios ativos. O homem pré-histórico, que aprendeu, como os
animais, a distinguir as plantas comestíveis daquelas que podiam ajudá-los a curar suas
doenças, já lançava mão da fitoterapia. Povos como os chineses, babilônios e egípcios já
cultivavam diversas ervas que eram utilizadas como purgantes, vermífugos, diuréticos,
anti-sépticos e cosméticos, além dos egípcios utilizarem diversos produtos para
embalsamar suas múmias (RATES, 2001).
As plantas são produtoras de substâncias químicas que podem ter alguma atividade
em outros organismos vivos. Baseado nessas atividades é que se procura os efeitos
terapêuticos para o tratamento de doenças tanto em animais como em humanos
(PROPPENGA, 2000). As plantas podem sintetizar dois tipos de metabólitos: primários e
secundários. Os metabólitos primários são substâncias amplamente distribuídas na
natureza, ocorrendo de uma forma ou de outra em praticamente todos os organismos. Nas
plantas superiores tais compostos se concentram freqüentemente em sementes e órgãos de
armazenamento e são necessários para o desenvolvimento fisiológico, já que possuem
papel importante no metabolismo celular básico. Eles são usados principalmente como
matéria prima industrial, alimento ou aditivo alimentar e inclui produtos tais como, óleos
vegetais, ácidos graxos (usados para fazer sabões e detergentes) e carboidratos (amido,
pectina e celulose). Normalmente os metabólitos primários são pouco valorizados no
mercado, mas existem exceções como o beta-caroteno, que é um produto caro em função
da dificuldade de extração, isolamento e purificação (CHAGAS, 2004).
Os metabólitos secundários são compostos derivados biologicamente dos
metabólitos primários. Eles não têm uma função aparente no metabolismo primário da
20
planta, mas freqüentemente têm um papel ecológico: atrativos para polinizadores,
representam adaptações químicas à pressão ambiental ou servem como defensores
químicos contra microrganismos, insetos e predadores superiores. Os metabólitos
secundários são freqüentemente armazenados pelas plantas em quantidades menores que os
metabólitos primários, sendo às vezes sintetizados em estágios de desenvolvimento
distintos da planta, o que muitas vezes dificulta sua extração e purificação. Desta forma,
muitos metabólitos secundários podem ser considerados como materiais especiais ou
químicos refinados e são mais valorizados no mercado. Eles são usados comercialmente
como compostos ativos biologicamente: farmacêuticos, conferindo sabor ou aroma e
pesticidas. Exemplos da utilidade comercial dos metabólitos secundários são a nicotina, a
morfina, a cocaína, os óleos de eucalipto, etc. Muitos destes produtos naturais secundários
freqüentemente tem estruturas altamente complexas, que determinam sua atividade
biológica e não podem ser economicamente sintetizados. Um bom exemplo é a
azadirachtina extraída do Neen, com estrutura bastante complexa e que é utilizada como
inseticida. Uma vantagem econômica tanto dos metabólitos primários e secundários é a
facilidade de obtenção através de processos relativamente simples, como a destilação a
vapor ou por extração com solventes aquosos ou orgânicos (CHAGAS, 2004).
Nos últimos anos tem-se observado um interesse crescente no uso de produtos
naturais, principalmente os derivados de plantas. Prova disso é que em 1997 o mercado de
produtos fitomedicinais movimentou 10 bilhões de dólares com um crescimento anual de
6,5% (RATES, 2001). Vale salientar que 25% das drogas prescritas mundialmente provém
de plantas, sendo 121 com tais compostos ativos em uso atual. Das 252 drogas
consideradas básicas e essenciais pela Organização Mundial da Saúde, 115 são
exclusivamente de origem vegetal e com um número significante de drogas sintéticas
obtidas a partir de seus prercusores. Alguns exemplos de drogas obtidas a partir de plantas
são a digoxina da Digitalis spp. a quinina e quinidina obtidas da Cinchona spp., vincristina
e vinblastina oriundas da Catharanthus roseus, atropina oriunda de Atropa belladona e a
morfina e codeína proveniente de Papaver somniferum (RATES, 2001).
A importância da medicina alternativa, em especial no Brasil, baseada em plantas
medicinais, deve-se ao elevado custo do desenvolvimento de compostos sintéticos, já que a
maioria das matérias primas são importadas, inviabilizando desta forma, sua aquisição pela
população. Vale salientar que a utilização de plantas medicinais traz vantagens ambientais
21
já que são produtos biodegradáveis e seu suprimento é auto-sustentável devido à
diversidade da flora medicinal (HAMMOND et al., 1997)
2.4.2. Plantas Medicinais com Atividade Anti-helmínticas na Medicina Veterinária
Várias plantas foram descritas como possuidoras de atividade anti-helmíntica.
ASUZU & ONU (1993) verificaram atividade anti-helmíntica do extrato etanólico da casca
de Piliostigma thonningii sobre larvas de terceiro estágio (L3) de Haemonchus spp.,
Oesophagostomum spp., Bunostomum spp. e Trichostrongylus spp. de bovinos. O extrato
promoveu 100% de mortalidade entre 2 e 15 horas nas espécies estudadas. Resultados
satisfatórios com a mesma planta foram obtidos sobre Ascaridia galli (ASUZU & ONU,
1994).
VIEIRA & CAVALCANTE (1991) verificaram redução de 30% na eliminação de
ovos nas fezes de caprinos tratados com Chenopodium ambrosioides. AMORIM et al.
(1996) testaram extratos aquosos de folhas de Annona squamosa e de epicarpo de Punica
granatum sobre larvas de primeiro estágio de nematóides gastrintestinais de bovinos
obtendo mortalidade de 19,5% e 84%, respectivamente. BATISTA et al. (1999) testaram
extratos aquosos de Spigelia anthelmia e Momordica charantia sobre a eclosão de ovos de
H. contortus concluindo que a dose inibitória de 50% dos ovos foi de 0,17 mg mL-1 para S.
anthelmia e de 0,1 mg mL-1 para M. charantia. ASSIS et al. (2003) demonstraram que o
extrato acetato de etila de folhas de S. anthelmia obteve um percentual médio de inibição
de eclosão de ovos de 100% na concentração de 50 mg mL-1, enquanto o extrato
metanólico inibiu na mesma concentração, 84,4%
do desenvolvimento larvar de H.
contortus. PESSOA et al. (2002), demonstraram, por sua vez, que tanto o óleo essencial de
Ocimum gratissimum L. como o seu principal constituinte, o eugenol, foram 100% eficazes
contra ovos de H. contortus a 0,5%.
O extrato aquoso, etanólico e o pó do fruto de Melia azedarach foram avaliados
quanto à eficácia sobre Ascaridia galli em galinhas infectadas experimentalmente. O pó e o
extrato etanólico promoveram uma redução de 58 e 68% do número de ovos por grama de
fezes (OPG), respectivamente (AKHTAR & RIFFAT, 1985).
BRAGA et al. (2001) avaliaram a ação anti-helmíntica das folhas de bananeira
frescas dadas ad libitum a bezerros mestiços de ambos os sexos, infectados naturalmente
22
por Haemonchus spp, Cooperia spp., Trichostrongylus spp. e Oesophagostomum spp.
observando uma redução significativa na média de OPG por coleta e na quantidade de L3
de Haemonchus spp.
2.4.3. Azadirachta indica
2.4.3.1. Considerações gerais
Azadirachta indica é uma planta pertencente à família Meliaceae, a mesma do
mogno, do cedro, cujo nome popular é Neen (Neem Foundation, 2001). É originária do sul
da Ásia, mais precisamente na Índia e da Birmânia. Por ser de clima tropical ocorre em
toda América Central, sul do Pacífico, Paquistão, Indonésia. No Brasil, a primeira
introdução oficial da planta ocorreu em 1984, por intermédio de um experimento em
Brasília. Atualmente, a árvore pode ser encontrada em todas as regiões do país, com
destaque para o município de Barreiras, no oeste da Bahia (LAREDO, 2003).
O Neen é uma planta que não exige solos de alta fertilidade, desenvolvendo-se bem
até em terrenos áridos. Não suporta, porém terra encharcada e ácida. A árvore se adapta
melhor em temperaturas que variam entre 8ºC e 40ºC. Quanto mais quente, mais rápido é
seu crescimento. Também se desenvolve em regiões com poucas chuvas e solos profundos,
tolerando índices pluviométricos que variam de 150 a 1800 mm anuais. Em condições
ideais a árvore pode atingir 11 m de altura em oito anos. Os frutos (Figura 2) começam a
aparecer em apenas três anos, possuem 2 cm de comprimento, são esverdiados e doces, o
que atrai pássaros. A árvore pode chegar a produzir cerca de 15 kg de fruto. As flores são
brancas e aromáticas (Figura 1), e as folhas são pequenas com 8 cm de comprimento. Uma
árvore produz 7 t de folhas (LAREDO, 2003).
Figura 1: Flores e folhas de Azadirachta indica
Figura 2: Folhas e frutos de Azadirachta indica
23
2.4.3.2. Composição Química
O Neen possui cerca de 40 ingredientes ativos, sendo o principal grupo constituído
de 3 ou 4 compostos bastante semelhantes. Os principais compostos ativos pertencem a
uma classe de produtos naturais conhecidos como triterpenos, mais especificamente, os
limonóides. Os mais conhecidos e com maior atividade pesticida são a azadirachtina,
salanina, meliantriol, nimbidina e a nimbina (FACT SHEET, 1997).
Dentre estes
compostos a azadiractina é o composto inseticida de maior quantidade encontrado em
sementes (MULLA & TIANYUN SU, 1999) e em folhas (FACT SHEET, 1997). A
azadarachtina foi um dos primeiros princípios ativos a serem isolados atribuindo-se a este
composto cerca de 90% dos efeitos causados nos insetos. Existe uma variação nos
isômeros que variam de AZ-A (azadiractina-A) a AZ-G (azadiractina-G). A azadiractina-A
é o componente encontrado em maior quantidade, porém a azadiractina-E é o análogo com
maior atividade inseticida (HOWATT, 2002). A azadiractina-B está presente em
concentrações de até 15%. Os demais análogos encontram-se em quantidades menores
(MULLA & TIANYUN SU, 1999). Atualmente existem outros compostos ativos
identificados e isolados como o nimbidol, gedunim, nimbinato de sódio, quercentina,
dentre outros, extraídos de diferentes partes da planta (CONRICK, 1994). Estes compostos
podem ser extraídos por muitos métodos. O arraste com água é o método mais antigo e
ainda utilizado para extrair seletivamente a azadiractina. Utiliza-se também a extração por
meio de solventes não polares, hexano, etanol, metanol e diclorometano são utilizados para
obtenção do conjunto de compostos químicos existentes na planta. (FACT SHEET, 1997).
2.4.3.3. Mecanismos de ação
O mecanismo de ação da planta se diferencia pelo composto químico presente e
pelo organismo a combater. (SCHUMUTTERER, 1990).
A azadarachtina não mata instantaneamente os insetos porém impede que
continuem a se alimentar. Além disso, interfere no desenvolvimento e já foi demonstrado
ser um dos mais potentes reguladores de crescimento de insetos pesquisados nos últimos
20 anos (FACT SHEET, 1997). Essa substância repele ou reduz a ingestão de alimentos de
várias espécies de insetos prejudiciais às lavouras bem como de alguns nematóides (FACT
24
SHEET, 1997). Na verdade ela é tão potente que um simples traço de sua presença impede
que alguns insetos cheguem até a tocar as plantas. A azadarachtina é estruturalmente
similar ao hormônio chamado ecdisona que controla o processo de metamorfose das
diversas fases da vida do inseto (larva, pupa e inseto adulto). Ela afeta o Corpus cardiacus,
um órgão semelhante à glândula pituitária da espécie humana, que controla a secreção de
hormônios. A metamorfose requer uma sincronia perfeita de vários hormônios e outras
mudanças fisiológicas para ser bem sucedida e a azadarachtina é um bloqueador de
ecdisona. Ela bloqueia a produção e a liberação desse hormônio vital para os insetos. Os
insetos então não fazem a muda, interferindo no seu ciclo de vida. Outra influência da
inibição da liberação desse hormônio é afetar no desenvolvimento ovariano, fecundidade e
fertilidade (viabilidade dos ovos) resultando numa supressão da fecundidade e esterilização
(MULLA & TIANYUN SU, 1999). Foi observado que vetores de patógenos como o
Trypanossoma cruzi tiveram seu desenvolvimento afetado quando tratados com uma única
dose de azadiractina (MULLA & TIANYUN SU, 1999). O melantriol é um outro inibidor
alimentar que em concentrações extremamente baixas tem o efeito de paralisar a
alimentação dos insetos. Esse efeito foi pela primeira vez demonstrado nos gafanhotos. A
salanina foi o terceiro terpenoide a ser isolado do Neen. Estudos indicaram que a salanina é
também extremamente poderosa na sua ação anti-alimentar porém não interfere na
metamorfose. A pesquisa também demonstrou que alguns ingredientes em menores
quantidades conseguem até paralisar o mecanismo de deglutição, desta forma impedem os
insetos de se alimentarem. Dentre esses limonóides secundários foram isolados o
deacetilazadarachtinol (CONRICK, 1994; MULLA & TIANYUN SU, 1999).
2.4.3.4. Potencial uso da planta
O Neen foi utilizado primeiramente contra pragas caseiras e de armazéns, mas na
Índia, tem uso restrito às pragas da cultura do arroz (NEVES & NOGUEIRA, 1996). Uma
das principais áreas de concentração de pesquisas de atividades do Neen é na agricultura.
Após uma avaliação em que se comparou mais de 250 plantas com alguma atividade
inseticida, os cientistas foram unânimes em declarar que o Neen era o mais efetivo, além
de ser ecologicamente correto (CONRICK, 1994). A pasta do Neen tem sido empregada
na Índia nas culturas do arroz e da cana-de-acúcar desde de 1993, visando combater a
Diatraea saccharalis e o cupim (NEVES E NOGUEIRA, 1996).
25
A planta e seus derivados chegam a afetar mais de 200 espécies de insetos
pertencentes às ordens Coleóptera (bezouros), Díptera (mosca de frutas, mosca do chifre e
moscas domésticas), Heteroptera (insetos que atacam lavouras de café, arroz, hortaliças),
Homóptera (cigarras e pulgões), Hymenoptera (abelhas, vespas e formigas), Lepidóptera
(mariposas e borboletas), Orthoptera (gafanhotos, grilos, esperanças), Thysanoptera
(larvas do solo) (NEVES & NOGUEIRA, 1996).
MITCHELL et al. (1997) verificaram que a azadirachthina juntamente com outros
compostos isolados também de sementes, como a salanina, nimbina e 6-diacetilnimbina,
mostraram atividade inibitória sobre a ecdisona 20-monooxigenase, enzima responsável
pelo desenvolvimento das larvas de insetos, Drosophila melanogaster, Aedes aegypti e
Manduca sexta.
Além de atividade sobre insetos, descobriu-se outras atividades farmacológicas da
planta. CONRICK (1994) relatou em trabalho de revisão várias propriedades antissépticas,
dentre estas, a atividade de extratos do Neen sobre Staphylococcus aureus, Entamoeba coli
e Staphylococcus pyogenes. Há relatos que 1g de nimbidina, equivale a 800 UI de
penicilina ou 5 g de sulfato de estreptomicina (SING E SASTRY 1981 apud VALENTE,
2002).
Testes in vitro com folhas e extratos da casca de A. indica demonstraram atividade
contra o vírus da AIDS, além de estimular a resposta imune mediada por células
(CONRICK 1994). Como atividade anti-fúngica pode-se citar que as folhas de Neen
apresentaram atividade na suspensão da produção de aflotoxinas por fungos em amendoins
mofentos, milho e outras comidas. Vale ressaltar que o fungo permanece ativo, porém sua
habilidade de produzir aflotoxina é inibida (VALENTE, 2002).
Segundo levantamento feito por CONRICK (1994) o Neen tem excelente efeito em
problemas de pele como acne, eczema, pruridos, descamação e verrugas.
Com relação à atividade contra nematóides, a A. indica tem mostrado efeito tanto
contra parasitos de planta como de animais. Existem relatos da atividade de azadirachtina
contra fitonematóides que resulta numa redução dos nematóides com conseqüente aumento
do crescimento da planta afetada (AKHTAR, 1999; AKHTAR et al., 1996).
Com relação aos parasitos de animais, vários trabalhos relataram que a planta age
tanto sobre ecto como em endoparasitos.
O óleo das sementes de A. indica foi testado contra Bovicola ovis, um piolho que
ataca ovinos, comparando-se à formulação comercial de cipermetrina. Os ovinos tratados
26
com azadirachtina apresentaram menos piolho do que os tratados com cipermetrina,
durante um período de 48 dias de estudo (HEATH et al, 1995).
ABDEL-SHAFY e ZAYED (2002) avaliaram a atividade in vitro de extratos de
sementes de Neen sobre ovos e estágios imaturos e adultos de Hyalomma anatolicum
excavatum. Os ovos tratados com o extrato não apresentaram inibição de eclosão,
verificando na realidade, uma diminuição do tempo de eclosão. Porém as larvas eclodidas
apresentavam desenvolvimento incompleto e morreram em poucas horas. Foi observado
que as ninfas tratadas com os extratos resultaram em formas adultas defeituosas, mais
precisamente em machos, em que se observou a ausência ou encurtamento de articulações.
Nas formas adultas observou-se mortalidade dependente da dose do extrato.
PESSOA et al. (2002) testaram a atividade ovicida de azadiractina sobre ovos de H.
contortus, demonstrando que na concentração de 1%, 68% dos ovos não eclodiram.
VALENTE (2002) ao avaliar a atividade do Neen sobre larvas de 3º estágio de infecções
mistas de nematóides gastrintestinais, observou que nas concentrações de 6000, 8000 e de
1.0000 ppm provocou a morte de todas a larvas no 14° dia de tratamento. Ao avaliar a
redução da contagem de ovos nas fezes de animais tratados com o extrato de folhas secas
de Neen, VALENTE (2002) observou que não houve diferença estatística entre o grupo
tratado e o grupo controle. Porém PIETROSEMOLI et al. (1999) fornecendo folhas de
Neen parcialmente secas e misturadas nas dose de 10, 20 e 30% ao bloco mineral (sal
mineral mais farelo de trigo) na alimentação de bovinos, durante 98 dias, constataram a
redução do OPG dos animais a pasto.
27
3. JUSTIFICATIVA
O parasitismo gastrintestinal é um dos maiores obstáculos na produtividade do setor
da ovinocaprinocultura. No controle dessas nematodeoses vem sendo utilizados antihelmínticos de alto custo e algumas vezes pouco eficazes por desenvolverem parasitos
resistentes. Substâncias produzidas a partir de plantas podem oferecer uma oportunidade
para superar esses problemas, pois apresentam como vantagens o suprimento sustentável,
além de permitir a produção de animais utilizando produtos naturais, fator cada vez mais
valorizado.
Além de existir relatos de atividades contra parasitos de outras classes e espécies, a
planta A. indica possui ainda vantagem de adaptar-se muito bem às nossas condições
ecológicas, haja vista não ser exigente em termos de clima, solo e temperatura, sendo
inclusive seu lugar de origem, sul da Ásia, muito semelhante as nossas condições
ambientais.
28
4. OBJETIVOS
™
GERAL
•
Desenvolver um fitoterápico para controlar as nematodeoses gastrintestinais
de pequenos ruminantes através da utilização de produtos naturais que
venham a contribuir com a eficiência produtiva destes animais.
™
ESPECÍFICO
•
Avaliar a atividade anti-helmíntica, in vitro, dos extratos acetato de etila, e
etanólico das folhas de A. indica sobre ovos e larvas de H. contortus.
•
Avaliar in vivo a atividade das folhas secas de A. indica na redução do OPG
e da carga parasitária de ovinos naturalmente infectados por nematóides
gastrintestinais.
29
5. MATERIAL E MÉTODOS
5.1 Teste in vitro
Preparação dos extratos
Quatro quilos das partes aéreas de A. indica secas, a temperatura ambiente, foram
misturados a 8 L de álcool etílico. O material permaneceu em mistura com o solvente por
uma semana. Após este tempo, foi realizada filtração e o álcool etílico foi evaporado em
evaporador rotatório, obtendo-se o extrato etanólico. Esse extrato foi misturado a uma
quantidade equivalente em peso de sílica gel e realizada filtração a vácuo com os seguintes
solventes orgânicos: hexânico, clorofórmico, acetato de etila e etanólico obtendo-se,
respectivamente, após evaporação destes solventes, os extratos hexânico, clorofórmico,
acetato de etila e etanólico.
Cada extrato obtido foi diluído em Tween 80 na concentração de 3% (v/v) na
proporção 1:1, nas seguintes concentrações: 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 mg mL-1.
Obtenção de ovos e larvas
Fezes de carneiros portadores de infecção monoespecífica de H. contortus, foram
coletadas diretamente da ampola retal. Aproximadamente 10 g de fezes foram processadas
de acordo com a técnica descrita por HUBERT & KERBOEUF (1992) para extração de
ovos das fezes. Os ovos recuperados foram diluídos em água destilada. Para a obtenção das
larvas de primeiro estágio (L1), uma alíquota das fezes foram incubadas por 24 h em estufa
a 37°C.
Teste de eclosão de ovos (TEO)
Foram distribuídos aproximadamente 100 ovos frescos em 0,2 mL/poço de placa e
adicionadas ao mesmo volume do extrato. Após 48 horas, foram contados ovos e larvas
eclodidas ao microscópio. Cada concentração dos extratos acetato de etila e etanólico da
planta testada foi acompanhado de um controle negativo, contendo o diluente utilizado e
outro com tiabendazol (0,025 mg mL-1). Foram realizadas cinco réplicas por concentração
do extrato.
30
Teste de desenvolvimento larval (TDL)
Uma alíquota de 250 µL, contendo 250 L1 de H. contortus, foi mistura a 2 g de
fezes, trituradas e provenientes de animais livres de nematóides gastrintestinais,
juntamente
com o mesmo volume de extratos e suas respectivas concentrações,
permanecendo incubados por 5 dias. O controle negativo foi constituído pelo diluente
utilizado para o extrato e o positivo com ivermectina na concentração de 0,64 µl mL-1. Ao
final, contou-se o número de larvas de 3° estágio.
Estudo fitoquímico de A. indica
Os testes fitoquímicos para fenóis, taninos, leucoantocianidinas, flavonóides,
esteróides, triterpenos e alcalóides foram realizados com o extrato etanólico de acordo
com MATOS (1997). Estes testes baseiam-se na alteração da coloração do extrato após a
adição de determinados reagentes.
Análise Estatística
Os resultados do TEO e do TDL foram transformados pela fórmula log (x + 1) e
comparados entre as diferentes concentrações de um mesmo extrato e entre extratos
aplicando-se ANOVA e teste de Tukey (p<0,05) utilizando o programa Graph Pad Prism
Software 3.0.
5.2 Teste in vivo
Desenho experimental
Foram
utilizados 40 ovinos sem raça definida, machos com idade de 6-12 meses,
portadores de infecção natural. Os ovinos foram distribuídos em quatro grupos de 10
animais, de acordo com o peso corporal e o OPG. Os animais foram brincados e pesados
no início e no final do experimento. O grupo I foi tratado com folhas secas e trituradas de
A. indica misturadas ao concentrado, na proporção de 12 g de folhas por quilo de
concentrado. Diariamente eram distribuídas 2,5 kg dessa mistura para o grupo, de forma
que cada animal teve a disposição 250g da mistura, o que correspondeu a uma dose diária
31
de 0,1g de folha por quilo de animal vivo (0,1g/kg PV/dia). O grupo II recebeu o dobro da
dose do grupo I. O grupo III foi tratado com anti-helmíntico, com a dose recomendada pelo
fabricante, cujo princípio ativo foi o closantel (Diantel). O grupo IV não foi tratado,
constituindo-se no grupo controle. Cada grupo foi aleatoriamente alojado em piquetes de
380m2, contendo capim Tanzânia irrigado. Além da forragem existente, os animais tiveram
ainda água e sal mineral ad libitum. Os animais permaneceram nos piquetes no período de
11 de Novembro de 2003 a 11 de Março de 2004. Dentre os dez animais de cada grupo,
quatro foram sacrificados ao final do estudo, para análise da carga parasitária de acordo
com UENO & GONÇALVES (1998).
Exames de sangue e coprológico
Foram coletadas, quinzenalmente, amostras de fezes diretamente da ampola retal
para a realização do OPG pela técnica de McMaster modificada (UENO & GONÇALVES,
1998) e amostras de sangue, para realização do microhematócrito.
Procedimento de Necropsia
A necropsia foi realizada segundo WOOD et al. (1995). Para tanto, os animais
permaneceram em jejum por 24 h e então sacrificados e coletados o abomaso, intestino
delgado e o grosso. Foram coletadas alíquotas de 10 %, do conteúdo e lavado de cada
órgão. O abomaso foi imerso em água destilada e aquecido em estufa por 24 h a
temperatura de 37 °C, para promover o desprendimento dos parasitas da mucosa. A seguir,
acrescentou-se às amostras o mesmo volume de AFA (Ácido acético, Formol comercial,
Água destilada) aquecido para a fixação dos nematóides. Os parasitos de cada órgão foram
coletados e identificados.
Análise Estatística
Os resultados do OPG, assim como da carga parasitária foram analisados
utilizando-se o teste Kruskal Wallis. O hematócrito, assim como do desenvolvimento
ponderal dos animais foram submetidos a ANOVA, e teste Tukey a 5% de probabilidade..
A relação entre o hematócrito e o OPG foi realizada pelo coeficiente de correlação de
Spearman. O programa utilizado para todas as análises foi o Graph Pad Prism Software
3.0.
32
6. RESULTADOS
6.1 Testes in vitro
Os rendimentos obtidos de cada extrato após evaporação foram de 0,2387g para o
extrato hexânico, de 2,1397 g para o extrato clorofórmico, de 13,9956 g para o extrato
acetato de etila e de 54,1378 g para o extrato etanólico
A tabela 1 mostra a eficácia média dos extratos acetato de etila e etanólico testados
sobre ovos de H. contortus. Comparando-se os dois extratos observa-se que o extrato
etanólico apresentou uma elevada atividade ovicida na concentração de 3,12 mg mL-1, não
havendo diferença estatística entre o extrato na concentração de 50 mg mL-1 e o antihelmíntico utilizado (p>0,05). O extrato acetato de etila apresentou efeito ovicida somente
a partir da concentração de 25 mg mL-1, apresentando menor eficácia do que o extrato
etanólico (p>0,05).
A tabela 2 mostra a eficácia média dos extratos acetato de etila e etanólico sobre
larvas de H. contortus. A eficácia de ambos extratos é observada somente na concentração
de 50 mg mL-1, destacando-se o extrato etanólico, com uma eficácia média de 87,1%,
sendo equivalente à eficácia do anti-helmíntico (p>0,05) e diferente do controle (p<0,05).
Os extratos hexânico e clorofórmico não apresentaram atividade no TEO. Os
mesmos não foram utilizados no TDL, porque a quantidade foi insuficiente para realizar as
réplicas. Desta forma preferiu-se apenas analisar os extratos acetato de etila e etanólico.
33
Tabela 1. Percentual de eficácia média (±EP) dos extratos acetato de etila e etanólico de
Azadirachta indica sobre a inibição da eclosão dos ovos de H. contortus
Extratos
-1
Concentração (mg mL )
Acetato de Etila
Etanólico
50
68,9 ± 7,3 Aa
100 ± 0,0 Ba
25
79,5 ± 7,3 Aac
100 ± 0,0 Aa
12,5
18,6 ± 9,7 Ab
100 ± 0,0 Ba
6,25
29,3 ± 14,5 Ab
99,5 ± 0,3 Ba
3,12
3,4 ± 3,2 Ad
98,2 ± 1,0 Ba
Tiabendazol (0,025 mg mL-1)
99,5 ± 0,3 Ac
98,1 ± 1,7 Aa
Tween 80 3%
3,2 ± 3,2 Abd
1,5 ± 0,7 Ab
Letras minúsculas comparam médias entre linhas. Letras maiúsculas comparam médias
entre colunas (p<0,05).
Tabela 2. Percentual de eficácia média (± EP) dos extratos acetato de etila e etanólico de A.
indica.sobre a inibição do desenvolvimento das larvas de H. contortus.
Extratos
-1
Concentração (mg mL )
Acetato de Etila
Etanólico
50
54,9 ± 13,8 Aa
87,1 ± 4,4 Ba
25
33,7 ± 8,7 Aa
25,4 ± 7,9 Ab
12,5
33,0 ± 12,9 Aa
32,9 ± 19,9 Ab
6,25
31,3 ± 7,3 Aa
39,6 ± 14,8 Ab
3,12
39,1 ± 19,28 Aa
17,7 ± 13,1 Bb
Ivermectina (0,64 µl mL-1)
98,3 ± 0,9 Ab
93,8 ± 3,3 Aa
Tween 80 3%
3,2 ± 3,2 Ac
1,9 ± 1,7 Ac
Letras minúsculas comparam médias entre linhas. Letras maiúsculas comparam médias
entre colunas (p<0,05).
Os testes fitoquímicos revelaram no extrato etanólico a presença de flavonóides,
taninos condensados, triterpenóides pentacíclicos livres, saponinas e alcalóides, estes
últimos foram positivos para os reagentes de Mayer e de Draggendorff.
34
6.2 Testes in vivo
6.2.1 Contagem de ovos nas fezes
A tabela 3 mostra a evolução do OPG durante os 90 dias de experimento. No início
do experimento (dia 0), observa-se que não havia diferença estatística entre os grupos (P >
0,05). Após 15 dias, no grupo tratado com anti-helmíntico (grupo III), ocorreu uma
redução expressiva do OPG (P < 0,05). Nos demais grupos a queda foi verificada no 30°
dia pós-tratamento, enquanto no grupo III houve uma elevação (P > 0,05). Nos grupos I, III
e IV o OPG começou a elevar-se entre os dias 30 e 75, porém decrescendo após o 90° dia
(P> 0,05).
Tabela 3. Média (± DP) da contagem de ovos nas fezes (OPG) para os grupos de ovinos
tratados com Azadirachta indica e controles durante 90 dias.
Dias após o tratamento
Grupos
0
15
30
45
60
75
90
I
1.060 Aa
1.765 Ba
165 Ab
545 Ab
515 Ab
770 Ab
455 Ab
(± 1.151)
( ± 2.260)
(± 188,6)
(± 903,5)
(± 1.333)
(± 1.488)
(± 653,8)
1.035 Aa
1.995 Bab
970 Aa
370 Aa
175 Aa
285 Aac
1.335 Aa
(± 1.215)
(± 1.779)
(± 1.513)
(± 541,7)
(± 218,9)
(± 500)
(± 2.437)
1.035 Aa
25 Ab
270 Aab
505 Aac
765 Aac
680 Aab
475 Aab
(± 1.132)
(± 63,46)
(± 476,8)
(± 306,8)
(± 1.205)
(± 1.294)
(± 815,9)
1.050 Aa
2.085 Bab
210 Ab
345 Aab
370 Aab
855 Aab
410 Aab
(± 1.186)
(± 2.903)
(± 508,2)
(± 708,9)
(± 998,4)
(± 1.741)
(± 596,2)
II
III
IV
Letras maiúsculas comparam médias entre linhas. Letras minúsculas comparam médias
entre colunas. Grupo I – Tratado com 0,1g/kg PV; Grupo II – Tratado com 0,2 g/kg PV;
Grupo III – Closantel; Grupo IV – Sem tratamento
6.2.2 Carga parasitária
No abomaso foi encontrado apenas H. contortus, enquanto no intestino delgado,
Cooperia curticei. Nenhum parasito foi encontrado no intestino grosso. Comparando-se a
35
intensidade do parasitismo por H. contortus entre os tratamentos, observou-se a existência
de um número menor de parasitos isolados no grupo que recebeu anti-helmíntico e no
tratado com a planta na dose de 0,1g/kg (P> 0,05). Maior número de exemplares de C.
curticei foram recuperados nos grupos tratados com o anti-helmíntico e com a planta na
maior dose, porém não foi estatisticamente diferente (Tabela 4).
Tabela 4. Média (±DP) de nematóides adultos recuperados no trato digestivo de ovinos
tratados com Azadirachta indica e respectivos controles.
Tratamento
H. contortus
C. curticei
0,1g/kg
410 ± 787
2.563 ± 1.806
0,2g/kg
2.143 ± 1.740
715 ± 593,8
Controle positivo
1.040 ± 692,1
680 ± 515,9
Controle negativo
2.015 ± 2.355
1.063 ± 1.667
Controle positivo = Diantel; Controle negativo = sem tratamento
6.2.3 Hematócrito e Ganho de peso
A figura 1 mostra a variação do hematócrito entre os grupos utilizados durante os
90 dias de experimento. Ocorreu uma elevação no hematócrito médio, ao 15° e ao 45° dias,
somente no grupo que recebeu anti-helmíntico (P<0,05), retornando no final do
experimento, aos valores iniciais. Nos demais grupos não houve diferença significativa na
variação do hematócrito, apresentando valores ao redor de 25%. Também não foi
observada diferença comparando os grupos entre si (P>0,05). Existiu uma correlação
negativa com o OPG (r = - 0,12).
36
Figura 3. Percentagem média do hematócrito entre os grupos tratados com Azadirachta
indica e controles durante o período experimental.
% hematócrito
30
neen - 0,1g/Kg
neen - 0,2g/kg
anti-hlemíntico
25
controle
20
0
15
30
45
60
75
90
Tempo (dias)
O ganho de peso ponderal entre os grupos não foi estatisticamente diferente (P>
0,05) (Tabela 5).
Tabela 5. Ganho de peso médio ± desvio padrão de ovinos tratados com Azadirachta
indica aos 90 dias de tratamento e controles
Tratamento
Média de ganho de peso (kg)
0,1g/kg
3,5 ± 2,28
0,2g/kg
3,7 ± 2,5
Controle positivo
3,3 ± 2,91
Controle negativo
4,3 ± 2,91
Controle positivo = Diantel; Controle negativo = sem tratamento
37
7. DISCUSSÃO
Os testes in vitro demonstraram a eficácia ovicida e larvicida do extrato etanólico,
demonstrando a presença de constituinte químico que atua sobre ovos e larvas de H.
contortus. Comparando-se aos respectivos controles, este extrato, nas concentrações
utilizadas, mostrou desempenho comparável, já que o tiabendazol, inibiu 100% da eclosão
de ovos, e a ivermectina, 93,2% no desenvolvimento larvar. O tiabendazol e a ivermectina
são princípios ativos isolados, enquanto o extrato etanólico possui vários constituintes
químicos, dentre eles o princípio ativo com ação ovicida e larvicida, porém em pequenas
quantidades. Em geral o extrato de uma planta possui pequenas concentrações de princípio
ativo e um grande número de propriedades promissoras (RATES, 2001). Além disso, o
extrato etanólico de A. indica apresentou resultados superiores a outros extratos de plantas
tidas como anti-helmínticas. ASSIS et al. (2003) relataram que o extrato acetato de etila de
Spigelia anthelmia, responsável por 100% de atividade inibitória sobre ovos de H.
contortus na dose de 50 mg mL-1, inibiu em torno de 20 % da eclosão de ovos na
concentração de 3,1 mg mL-1, assim como COSTA et al (2001) observaram que o mesmo
extrato, porém da planta Momordica charantia na dose de 10 mg mL-1 inibiu 17 % da
eclosão de ovos de H. contortus. O extrato etanólico de A. indica na dose de 3,1 mg mL-1
inibiu 98,2% da eclosão de ovos.
Os testes fitoquímicos do extrato etanólico revelaram a presença de constituintes
químicos que podem ser responsáveis pela atividade ovicida e larvicida. Dentre esses
constituintes, detectou-se a presença de compostos triterpenóides. Segundo MULLA E
TIANYUN SU (1999) dentre os principais compostos ativos do Neen destacam-se os
pertencentes à classe dos triterpenos, mais especificamente, os limonóides. A azadiractina,
é um triterpenóide e o composto inseticida presente em maior quantidade nas sementes
(MULLA E TIANYUN SU, 1999) e folhas (FACT SHEET, 1997) do Neen. A azadiractina
a 10 mg mL-1 inibiu 68% da eclosão de ovos H. contortus (PESSOA et al. 2001), enquanto
os resultados do presente trabalho foram superiores na concentração de 3,12 mg mL-1.
Estes resultados sugerem que o princípio ativo responsável pela ação ovicida, não seja
somente a azadarachtina. Na classe dos triterpenos há outros constituintes químicos como a
salanina, nimbina, 6-desacetilnimbim. Analisando-se esses constituintes químicos,
separadamente, incluindo a azadiractina, observou-se que todos apresentaram atividade
sobre a enzima 20-monooxigenase (MITCHELL et al., 1997). Essa enzima é responsável
38
pela ativação de ecdisona, hormônio responsável pelo desenvolvimento de larvas dos
insetos. Desta forma,
a atividade do extrato não poderia ser atribuída à apenas um
composto químico, mas sim, a ação sinérgica de vários constituintes presentes na classe
dos triterpenos.
Outra substância identificada nos testes fitoquímicos são os taninos condensados.
Os taninos são compostos associados à defesa natural de plantas contra insetos, sendo
classificados, de acordo com suas propriedades e estrutura química, em hidrolisáveis e
condensados (BECKER & MAKKAR., 1999). A atividade antiparasitária dos taninos
condensados é atribuída a sua capacidade de ligar-se às proteínas. Essa ligação levaria a
uma diminuição da quantidade de proteínas disponíveis para as larvas, acarretando um
estado de inanição e morte (ATHANASIADOU et al., 2001). A viabilidade das larvas de
H. contortus, Teladorsagia circumcincta e Trichostrongylus vitrinus foi reduzida
utilizando-se o extrato de Quebracho, que é uma planta rica em taninos condensados
(ATHANASIADOU et al., 2001). Em insetos adultos e larvas, taninos condensados ligamse à mucosa intestinal causando autólise, levando a uma impossibilidade de utilização de
nutrientes por parte da larva (OTERO & HIDALGO, 2004). Este mecanismo poderia ser
uma outra forma de ação dos taninos condensados sobre as larvas de nematóides.
Portanto, devido aos resultados obtidos nos testes in vitro aliado a utilização
popular das folhas de Neen no combate do parasitismo gastrintestinal, procurou-se
comprovar, a partir desse trabalho, a ação anti-helmíntica das folhas de A. indica.
Os resultados do hematócrito variaram em função do OPG. Isso pode ser observado
comparando-se o grupo que recebeu anti-helmíntico com os demais. Ao receber closantel,
que é específico para H. contortus, no dia 0, o OPG diminuiu para uma média de 25% no
15° dia que foi acompanhado de uma melhora do hematócrito permanecendo elevado até o
45° dia (P< 0,05). Nos grupos tratados com Neen e no controle negativo o hematócrito
continuou abaixo dos valores de referência durante todo o experimento. Essa relação
também foi observada por KAPLAN et al. (2004) que relataram elevada população de H.
contortus, gerando uma diminuição dos níveis de hematócrito.
Vários trabalhos procuraram observar a atividade anti-helmíntica in vivo de folhas
de A.indica, porém em nenhum deles, os ovinos tratados com folhas de Neen apresentaram
redução do OPG. Isso foi observado tanto utilizando-se a dose de 0,5g/kg, 3 vezes por
semana, durante 3 semanas (GITHIORI, 2004); quanto na dose de 1 g/animal/dia durante
um mês (NIRMAL-SANGWAN et al, 1998). Os mesmos resultados foram obtidos
39
utilizando-se o extrato de folhas secas de Neen na dose de 0,08g/kg/24 h e 0,1g/kg durante
3 dias (VALENTE, 2002). Mesmo utilizando outras partes de A. indica, aliado a utilização
de um produto mais refinado, como um extrato, ainda assim, não se obteve um resultado
anti-parasitário esperado. Prova disso é que ovinos, artificialmente infectados com H.
contortus e Trichostrongylus colubriformis, quando tratados com o extrato etanólico de
sementes de A. indica na dose única de 3mg/kg, não apresentaram redução na contagem de
ovos nas fezes (HÖRDEGEN et al, 2003)
Duas hipóteses poderiam justificar a ausência de resultados anti-helmínticos: a
variação ambiental (MARTIN, McCORKLE & MATHIAS, 2001) e a duração do
tratamento. Todos os trabalhos citados acima, cujos resultados foram negativos para
atividade anti-helmíntica, foram executados em diferentes partes do mundo, demonstrando
a não influência do ambiente sobre os resultados. O tempo de tratamento, também pode ser
descartado, já que apesar dos trabalhos realizados, terem utilizado um curto período de
tempo, o presente estudo avaliou a atividade do Neen durante 90 dias de tratamento.
Porém o único trabalho utilizando folhas de Neen que apresentou atividade antihelmíntica foi de PIETROSEMOLI et al. (1999) em bovinos. Esses autores observaram
que bovinos tratados com folhas de Neen parcialmente desidratadas e misturadas ao bloco
mineral nas concentrações de 10; 20 e 30% apresentaram redução do OPG no 30° dia de
tratamento. Porém não foi observado efeito sobre a carga parasitária e o ganho de peso. O
efeito sobre o OPG não foi dose-dependente, sugerindo que outros fatores possam ter
causado a redução da eliminação de ovos nas fezes. É sabido que o exame de fezes pode
ser influenciado entre outros, pelas espécies de nematóides envolvidas, pela presença de
hipobiose, pelo estágio de desenvolvimento dos nematóides, pela resistência individual do
animal (ECHEVARRIA, 1996). Por isso o teste controlado é indispensável para confirmar
o efeito anti-helmíntico, comparando a carga parasitária de animais tratados e não tratados.
Portanto, as folhas de A. indica usadas no tratamento em ovinos, de acordo com o
protocolo utilizado, não apresentou atividade anti-helmíntica. Em virtude dos resultados in
vitro com o extrato etanólico de folhas, sugere-se que os próximos testes in vivo sejam
realizados utilizando esse extrato, sem esquecer da realização de testes farmacológicos e de
toxicidade.
40
CONCLUSÕES
Com relação aos testes in vivo, os resultados não foram satisfatórios nos grupos
tratados quando comparados com o grupo controle.
O extrato etanólico, nos testes in vitro, apresentou eficácia tanto ovicida como
larvicida sobre H. contortus.
41
PERSPECTIVAS
A partir desse trabalho surgem novas perspectivas para a utilização de A. indica,
principalmente com a utilização do extrato etanólico de folhas, sendo necessário encontrar
a dose compatível com atividade anti-parasitária in vivo.
42
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51
ANEXO I
ARTIGO
ATIVIDADE OVICIDA E LARVICIDA DE EXTRATOS DE Azadirachta indica A.
Juss SOBRE Haemonchus contortus
Artigo submetido à revista: Ciência Animal
Cícero Temístocles Coutinho Costa1, Michelline do Vale Maciel1, Ana Lourdes Fernandes
Vasconcelos1, Marta Maria Caetano de Souza1, Cristine Maria Sousa de Castro2, Selene Maia de
Morais2, Claudia Maria Leal Bevilaqua1.
1
Laboratório de Doenças Parasitárias – PPGCV/UECE; 2 Laboratório de Química
52
1. Introdução
As nematodeoses gastrintestinais são uma das principais limitações para uma eficiente
produção de pequenos ruminantes no nordeste brasileiro (PADILHA, 1982), especialmente
quando o parasito abomasal Haemonchus contortus está envolvido.
O controle do parasitismo gastrintestinal em ovinos e caprinos é normalmente realizado
com anti-helmínticos. Contudo, o rápido desenvolvimento de cepas de nematóides
resistentes a essas drogas, associado ao alto custo, resíduos nos alimentos e poluição
ambiental tem despertado a busca de alternativas como as plantas medicinais (HERD,
1996; HAMMOND et al.; 1997). Substâncias produzidas a partir de plantas podem
permitir a superação desse problema, já que possuem a vantagem do suprimento
sustentável e são ecologicamente aceitas.
Azadirachta indica é uma planta pertencente à família Meliaceae, a mesma do
mogno, do cedro, cujo nome popular é Neen (Neem Foundation, 2001).Vários trabalhos
têm demonstrado que A. indica age sobre ectoparasitos, como Bovicola ovis (HEATH et
al, 1995) e Hyalomma anatolicum excavatum (ABDEL-SHAFY e ZAYED, 2002).
PESSOA et al.(2002) utilizando azadirachtin, um composto químico extraído de sementes
desta planta, observaram atividade ovicida, in vitro, de 68% sobre H. contortus.
O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito ovicida e larvicida dos extratos
acetato de etila e etanólico de folhas A. indica sobre H. contortus.
2. Material e Métodos
2.1 Preparação dos extratos
Quatro quilos das partes aéreas de A. indica secas, a temperatura ambiente, foram
misturados a 8 L de álcool etílico. O material permaneceu em mistura com o solvente por
uma semana. Após este tempo, foi realizada filtração e o álcool etílico foi evaporado em
evaporador rotatório, obtendo-se o extrato etanólico. Esse extrato foi misturado a uma
quantidade equivalente em peso de sílica gel e realizada filtração a vácuo com os seguintes
solventes orgânicos: hexânico, clorofórmico, acetato de etila e etanólico obtendo-se,
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respectivamente, após evaporação destes solventes, os extratos hexânico, clorofórmico,
acetato de etila e etanólico.
Cada extrato obtido foi diluído em Tween 80 na concentração de 3% (v/v) na
proporção 1:1, nas seguintes concentrações: 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 mg mL-1.
2.2 Obtenção de ovos e larvas
Fezes de carneiros portadores de infecção monoespecífica de H. contortus, foram
coletadas diretamente da ampola retal. Aproximadamente 10 g de fezes foram processadas
de acordo com a técnica descrita por HUBERT & KERBOEUF (1992) para extração de
ovos das fezes. Os ovos recuperados foram diluídos em água destilada. Para a obtenção das
larvas de primeiro estágio (L1), uma alíquota das fezes foram incubadas por 24 h em estufa
a 37°C.
2.3 Teste de eclosão de ovos (TEO)
Foram distribuídos aproximadamente 100 ovos frescos em 0,2 mL/poço de placa e
adicionadas ao mesmo volume do extrato. Após 48 horas, foram contados ovos e larvas
eclodidas ao microscópio. Cada concentração dos extratos acetato de etila e etanólico da
planta testada foi acompanhado de um controle negativo, contendo o diluente utilizado e
outro com tiabendazol (0,025 mg mL-1). Foram realizadas cinco réplicas por concentração
do extrato.
2.4 Teste de desenvolvimento de larval (TDL)
Uma alíquota de 250 µL, contendo 250 L1 de H. contortus, foi mistura a 2 g de
fezes, trituras e provenientes de animais livres de nematóides gastrintestinais, juntamente
com o mesmo volume de extratos e suas respectivas concentrações, permanecendo
incubados por 5 dias. Ao final contou-se o número de larvas de 3° estágio. Como controle
utilizou-se ivermectina a 0,64 µL ml-1.
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2.5 Estudo fitoquímico de A. indica
Os testes fitoquímicos para fenóis, taninos, leucoantocianidinas, flavonóides,
esteróides, triterpenos e alcalóides foram realizados com o extrato etanólico de acordo
com (MATOS, 1997). Estes testes baseiam-se na alteração da coloração do extrato após a
adição de determinados reagentes.
2.6. Análise Estatística
Os resultados do TEO e do TDL foram transformados pela fórmula log (x + 1) e
comparados entre as diferentes concentrações de um mesmo extrato e entre extratos
aplicando-se ANOVA e teste de Tukey (p<0,05) utilizando o programa Graph Pad Prism
Software 3.0.
3 Resultados
Os rendimentos obtidos de cada extrato após evaporação foram de 0,2387g para o
extrato hexânico, de 2,1397 g para o extrato clorofórmico, de 13,9956 g para o extrato
acetato de etila e de 54,1378 g para o extrato etanólico.
A tabela 1 mostra a eficácia média dos extratos acetato de etila e etanólico testados
sobre ovos de H. contortus. Comparando-se os dois extratos observa-se que o extrato
etanólico apresentou uma elevada atividade ovicida na menor concentração, 3,12 mg mL-1,
não apresentando diferença estatística com a maior concentração e nem com o antihelmíntico (p>0,05). O extrato acetato de etila apresentou efeito ovicida somente a partir
da concentração de 25 mg mL-1, apresentando uma eficácia menor do que o extrato
etanólico (p>0,05).
A tabela 2 mostra a eficácia média dos extratos acetato de etila e etanólico sobre
larvas de H. contortus. A eficácia de ambos os extratos é observada somente na
concentração de 50 mg mL-1, destacando-se o extrato etanólico, com uma eficácia média
de 87,11%, sendo equivalente à eficácia do anti-helmíntico (p>0,05) e diferente do
controle (p<0,05).
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Tabela 1. Percentual de eficácia média (±EP) dos extratos acetato de etila e etanólico de
Azadirachta indica sobre a inibição da eclosão dos ovos de H. contortus
Extratos
-1
Concentração (mg mL )
Acetato de Etila
Etanólico
50
68,9 ± 7,3 Aa
100 ± 0,0 Ba
25
79,5 ± 7,3 Aac
100 ± 0,0 Aa
12,5
18,6 ± 9,7 Ab
100 ± 0,0 Ba
6,25
29,3 ± 14,5 Ab
99,5 ± 0,3 Ba
3,12
3,4 ± 3,2 Ad
98,2 ± 1,0 Ba
Tiabendazol (0,025 mg mL-1)
99,5 ± 0,3 Ac
98,1 ± 1,7 Aa
Tween 80 3%
3,2 ± 3,2 Abd
1,5 ± 0,7 Ab
Letras minúsculas comparam médias entre linhas. Letras maiúsculas comparam médias
entre colunas (p<0,05).
Tabela 2. Percentual de eficácia média (± EP) dos extratos acetato de etila e etanólico de A.
indica.sobre a inibição do desenvolvimento das larvas de H. contortus.
Extratos
-1
Concentração (mg mL )
Acetato de Etila
Etanólico
50
54,9 ± 13,8 Aa
87,1 ± 4,4 Ba
25
33,7 ± 8,7 Aa
25,4 ± 7,9 Ab
12,5
33,0 ± 12,9 Aa
32,9 ± 19,9 Ab
6,25
31,3 ± 7,3 Aa
39,6 ± 14,8 Ab
3,12
39,1 ± 19,28 Aa
17,7 ± 13,1 Bb
Ivermectina (0,64 µl mL-1)
98,3 ± 0,9 Ab
93,8 ± 3,3 Aa
Tween 80 3%
3,2 ± 3,2 Ac
1,9 ± 1,7 Ac
Letras minúsculas comparam médias entre linhas. Letras maiúsculas comparam médias
entre colunas (p<0,05).
Com
relação aos testes fitoquímicos, estes revelaram, no extrato etanólico, a
presença de flavonóides; taninos condensados; triterpenóides pentacíclicos livres;
saponinas e alcalóides tanto com relação aos reagentes de Mayer como de Draggendorff.
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4 Discussão
Pelo presente trabalho pode-se observar a eficácia ovicida e larvicida do extrato
etanólico, demonstrando a presença de algum constituinte químico que atua sobre ovos e
larvas de H. contortus. Comparando-se aos respectivos
controles, o extrato, nas
concentrações utilizadas, mostrou desempenho comparável, já que o tiabendazol, na dose
0,025 mg mL-1 inibiu 100% da eclosão de ovos, e o controle com ivermectina, na dose de
0,64 µl mL-1 inibiu 93,2% de desenvolvimento larval. O tiabendazol e a ivermectina são
princípios ativos isolados, enquanto o extrato etanólico possui vários constituintes
químicos, dentre eles o princípio ativo com ação ovicida e larvicida, porém em pequenas
quantidades. Em geral o extrato de uma planta possui pequenas concentrações de princípio
ativo e um grande número de propriedades promissoras (RATES, 2001).
Os testes fitoquímicos do extrato etanólico, revelaram a presença de constituintes
químicos que podem ser responsáveis pela atividade anti-helmíntica encontrada in vitro.
Dentre esses constituintes, detectou-se a presença de compostos triterpenóides. Segundo o
MULLA E TIANYUN SU (1999) dentre os principais compostos ativos do Neen
destacam-se os pertencentes à classe dos triterpenos, mais especificamente, os limonóides.
A azadiractina, um, triterpenóide, é o composto inseticida de maior quantidade encontrado
em sementes (MULLA E TIANYUN SU, 1999) e em folhas (FACT SHEET, 1997) do
neen. A azadiractina a 1% inibiu 68% da eclosão de ovos H. contortus (PESSOA et al.
2001). Nossos resultados foram melhores utilizando uma concentração de 3,12 mg mL-1.
Com isso podemos levantar a hipótese de que o princípio ativo responsável pela ação
ovicida, não seja somente a azadarachtina. Isso porque dentro da classe dos triterpenos há
outros constituintes químicos como a salanina, nimbina, 6-desacetilnimbim. Analisando-se
esses constituintes químicos, separadamente, incluindo a azadiractina, observou-se que
todos apresentavam atividade sobre a enzima 20-monooxigenase (MITCHELL et al.,
1997). Essa enzima é responsável pela ativação do ecdisona, hormônio responsável pela
desenvolvimento das larvas dos insetos. Desta forma, o a atividade do extrato não poderia
ser atribuída apenas a um único composto químico, mas sim, a ação sinérgica de vários
constituintes presentes na classe dos triterpenos. COSTA et al. (2002) observaram, ao
avaliar o extrato etanólico de semente de Mangifera indica, 95% de eficácia contra a
eclosão de ovos de H. contortus, na dose de 50 mg mL-1 e cujos testes fitoquímicos
também revelaram a presença de triterpenos, além de taninos e saponinas.
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Outra possibilidade para a ação anti-helmíntica, possa ser os taninos condensados,
identificados nos testes fitoquímicos. Os taninos são compostos associados à defesa natural
de plantas contra insetos, sendo classificados, de acordo com suas propriedades e estrutura
química, em hidrolisáveis e condensados (BECKER & MAKKAR., 1999). A atividade
antiparasitária dos taninos condensados é atribuída a sua capacidade de ligar-se às
proteínas. Essa ligação levaria a uma diminuição da quantidade de proteínas disponíveis
para as larvas, acarretando um estado de inanição e morte (ATHANASIADOU et al.,
2001). A viabilidade das larvas de H. contortus, Teladorsagia circumcincta e
Trichostrongylus vitrinus foi reduzida utilizando-se o extrato de Quebracho, que é uma
planta rica em taninos condensados (ATHANASIADOU et al., 2001). OTERO &
HIDALGO (2004) relataram que insetos e larvas de insetos ao ingerir taninos
condensados, estes ligavam-se à mucosa intestinal causando autólise, levando a uma
impossibilidade de utilização de nutrientes por parte da larva. Este mecanismo poderia ser
uma outra forma de ação dos taninos condensados sobre as larvas de nematóides. Com
relação ao efeito ovicida, este pode ser explicado pela inibição da formação dos
microtúbulos do centríolo, como o que acontece com os benzimidazóis, já que é um
mecanismo de ação bastante peculiar dessa classe de anti-helmíntico (LACEY et al.;
1987). Com relação ao efeito ovicida, este pode ser explicado pela inibição da formação
dos microtúbulos do centríolo, como o que acontece com os benzimidazóis, já que é um
mecanismo de ação bastante peculiar dessa classe de anti-helmíntico (LACEY et al.;
1987).
Em conclusão, os resultados encontrados no presente trabalho demonstram a possibilidade
da utilização da planta A. indica, em especial, o extrato etanólico, contra o parasitismo
gastrintestinal de pequenos ruminantes.
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