influência de bactérias endofíticas na fisiologia de plantas de
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INSTITUTO AGRONÔMICO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA TROPICAL E SUBTROPICAL INFLUÊNCIA DE BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS NA FISIOLOGIA DE PLANTAS DE CANA-DE-AÇÚCAR SOB RESTRIÇÃO HÍDRICA FERNANDA CASTRO CORREIA MARCOS Orientadora: Ana Maria Magalhães Andrade Lagôa Co-orientadora: Adriana Parada Dias da Silveira Dissertação submetida como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Agricultura Tropical e Subtropical, Área de Concentração em Tecnologia de Produção Agrícola Campinas, SP Abril 2012 Ficha elaborada pela bibliotecária do Núcleo de Informação e Documentação do Instituto Agronômico de Campinas M625 i Marcos, Fernanda Castro Correia Influência de bactérias endofíticas na fisiologia de plantas de cana-de-açúcar sobre restrição hídrica / Fernanda Castro Correia Marcos Campinas, 2012. 64fls Orientadora: Ana Maria Magalhães Andrade Lagôa Co-orientadora: Adriana Parada Dias da Silveira Dissertação (Mestrado) em Agricultura Tropical e Subtropical 1. Cana-de-açúcar – planta-bactéria I. Lagôa Ana Maria Magalhães Andrade II. Silveira, Adriana Parada Dias da III. Título CDD 633.61 ii iii Aos meus pais Maria José e César, Aos meus avós Maria da Graça e Antônio (in memorian) Ao meu irmão Gabriel, e à Lilian Pelo incentivo, compreensão e amor, e A mais nova integrante da família a Beatriz DEDICO iv AGRADECIMENTOS Aos meus pais, pela educação, valores e princípios que me fizeram aproveitar as oportunidades que surgiram durante minha trajetória de vida e também pelo amor e carinho. Em especial a minha mãe que me ajudou a cuidar do experimento em casa de vegetação; À minha avó, por todos os mimos e ensinamentos; Ao meu irmão Gabriel e esposa Lilian, pelo amor, amizade e conversas que sempre tivemos, e eventual ajuda na coleta de dados; À Dra. Ana Maria Magalhães Andrade Lagôa e à Dra. Adriana Parada Dias da Silveira pela oportunidade que me deram e pela amizade e orientação; A todos os pesquisadores do Laboratório de Fisiologia Vegetal Coaracy de Moraes Franco em especial ao Dr. Eduardo Caruso Machado e Dr. Rafael Vasconcelos Ribeiro pelos conselhos e ensinamentos; À Dra. Sueli dos Santos Freitas pela amizade, ensinamentos e pelos momentos gastronômicos; Ao Laboratório de Microbiologia do Solo pela disponibilidade de uso da infraestrutura e a todos os amigos Matheus Cipriano, Júlia Talazzo, Elaine Rodrigues, Ana Olívia Fernandes, Régia a técnica Rosana Gonçalves Giertz, ao Sr. Lazinho, e em especial à Raquel de Paula Freitas por todos os momentos de trabalho e muita diversão; À todos os colegas do laboratório de Fisiologia Vegetal Coaracy de Moraes Franco Daniela Machado, Ricardo Machado, José Rodrigues, Paulo Marchiori, Karina Silva, Pedro Rampazzo, Fernanda Vilela e Rafaely Lameira pela ajuda no experimento de campo e no laboratório; À amiga Verónica Lorena Dovis por todos os ensinamentos e ajuda durante grande parte do mestrado e também pelos bons momentos de convívio; À amiga Cristina Sales pela ajuda constante em todas as etapas de desenvolvimento do trabalho; Às minhas queridas amigas Flávia Maria, que sempre me incentivou a trabalhar com pesquisa e esteve ao meu lado em momentos difíceis, e Andréa Borges, pela ajuda sempre que necessária e pelo carinho e compreensão; Aos amigos da academia que foram muitas vezes essenciais para a manutenção do bem estar físico e mental durante esses dois anos; Ao Jefferson, por ter me proporcionado carinho e tranqüilidade na fase final do trabalho; v À todos os amigos da PG/IAC; À CAPES e à FAPESP/BIOEN pelo suporte financeiro; A todos os professores do Programa de Pós Graduação do IAC, pelos ensinamos; À Pós Graduação e ao Instituto Agronômico pela oportunidade; vi “Quanto maior é o obstáculo, maior será a glória de tê-lo superado” Molière vii SUMÁRIO LISTA DE ABREVIAÇÕES ..................................................................................................... x LISTA DE TABELAS .............................................................................................................. xi LISTA DE FIGURAS .............................................................................................................. xii RESUMO ................................................................................................................................ xvi ABSTRACT ........................................................................................................................... xvii 1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................................... 1 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................................ 3 2.1 Aspectos gerais da cultura da cana-de-açúcar ...................................................................... 3 2.2 Efeitos da deficiência hídrica na fisiologia vegetal .............................................................. 4 2.3 Interações benéficas entre planta e bactérias endofíticas diazotróficas ................................ 9 3 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................... 15 3.1 Material vegetal e isolados bacterianos .............................................................................. 15 3.2 Delineamento experimental ................................................................................................ 17 3.2.1 Primeiro experimento: desenvolvimento de plantas cana-de-açúcar tratadas com inóculos bacterianos e sob disponibilidade hídrica adequada. ................................................. 17 3.2.2 Segundo experimento: desenvolvimento de plantas de cana-de-açúcar tratadas com inóculos bacterianos e sob condição de restrição hídrica. ........................................................ 17 3.3 Medidas de crescimento ..................................................................................................... 18 3.4 Potencial hídrico e conteúdo relativo de água na folha ...................................................... 18 3.5 Trocas gasosas .................................................................................................................... 18 3.6 Atividade fotoquímica ........................................................................................................ 19 3.7 Conteúdo de clorofilas ........................................................................................................ 19 3.8 Extração de compostos por MCW ...................................................................................... 19 3.9 Teor de carboidratos foliares .............................................................................................. 20 3.10 Teor de prolina.................................................................................................................. 21 3.11 Teor de aminoácidos livres totais ..................................................................................... 21 3.12 Teor de nitrogênio total em folhas .................................................................................... 22 3.13 Extração enzimática.......................................................................................................... 22 3.14 Atividade enzimática in vitro da redutase do nitrato ........................................................ 23 3.15 Atividade enzimática in vitro da sintetase da glutamina .................................................. 23 3.16 Quantificação de bactérias presentes nos colmos e nas raízes ......................................... 24 3.17 Delineamento estatístico e análise de dados ..................................................................... 24 4 RESULTADOS ..................................................................................................................... 25 4.1 Efeitos da interação planta-bactéria na fisiologia de cana-de-açúcar sob disponibilidade hídrica adequada. ...................................................................................................................... 25 4.1.1 Contagem de bactérias endofíticas .................................................................................. 25 4.1.2 Aspectos biométricos....................................................................................................... 25 4.1.3 Potencial hídrico e conteúdo relativo de água ................................................................. 26 4.1.4 Teores de prolina e aminoácidos livres totais .................................................................. 27 4.1.5 Atividade fotoquímica ..................................................................................................... 28 4.1.6 Clorofila a, b e total ......................................................................................................... 28 4.1.7 Trocas gasosas ................................................................................................................. 29 4.1.8 Carboidratos foliares........................................................................................................ 31 4.1.9 Nitrogênio ........................................................................................................................ 31 4.1.10 Enzimas do metabolismo do nitrogênio ........................................................................ 32 4.2 Atenuação dos efeitos da restrição hídrica pela interação com bactérias diazotróficas endofíticas ................................................................................................................................. 33 4.2.1 Contagem de bactérias diazotróficas endofíticas............................................................. 33 viii 4.2.2 Altura e número de folhas ............................................................................................... 34 4.2.3 Massa de matéria seca da parte aérea e das raízes ........................................................... 34 4.2.4 Potencial hídrico e conteúdo relativo de água ................................................................. 35 4.2.5 Teores de prolina e de aminoácidos livres totais (ALT) .................................................. 36 4.2.6 Atividade fotoquímica ..................................................................................................... 38 4.2.7 Clorofila total................................................................................................................... 38 4.2.8 Trocas gasosas ................................................................................................................. 39 4.2.9 Carboidratos .................................................................................................................... 42 4.2.10 Nitrogênio ...................................................................................................................... 44 4.2.11 Atividade de enzimas do metabolismo do nitrogênio ................................................... 45 5 DISCUSSÃO ......................................................................................................................... 47 5.1 Efeitos da interação planta-bactéria na fisiologia de cana-de-açúcar ................................. 47 5.2 Atenuações dos efeitos do estresse hídrico por bactérias endofíticas diazotróficas ........... 51 6 CONCLUSÕES ..................................................................................................................... 55 7 REFERÊNCIAS BIBIOGRÁFICAS ..................................................................................... 56 ix LISTA DE ABREVIAÇÕES A ABA AMI AST ATP BSA Ci CRA DAP DTT EDTA E ETR FAD FM FV F V /F M GGH Glu gs JMV JNFb LGI-P MCW MF MS MT NADH NPQ PMSF PVPP Q R RN SAC SG TCA Ψw Assimilação líquida de CO 2 Ácido abscísico Amido Açúcares solúveis totais Adenosina trifosfato Albumina de soro bovino Concentração intercelular de CO 2 Conteúdo relativo de água Dias após o plantio Ditiotreitol Ácido etilenodiamino tetra-acético Transpiração Transporte aparente de elétrons Flavina adenina dinucleotídeo Fluorescência máxima em tecidos adaptados ao escuro Fluorescência variável no escuro Eficiência quântica potencial do fotossistema II em tecidos adaptados ao escuro γ-glutamil-hidroximato Glicose Condutância estomática Meio de cultura semi-específico para o gênero Burkholderia Meio de cultura semi-específico para o gênero Herbaspirillum Meio de cultura semi-específico para G. diazotrophius Metanol, clorofórmio e água Massa fresca Massa Seca Massa Túrgida Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Coeficiente de extinção não fotoquímica da fluorescência Fluoreto de fenilmetilsultonil Polivinilpolipirrolidona Radiação fotossinteticamente ativa (µmol m-2 s-1) Respiração no escuro Redutase do nitrato Sacarose Sintetase da glutamina Ácido tricloroacético Potencial hídrico x LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Número mais provável (NMP) de bactérias, no início do experimento, nos colmos dos genótipos IACSP94-2094 e IACSP95-5000, utilizados para produção de mudas, em três meios de cultura (JNFb, LGIP, JMV)...........................................25 Tabela 2 – Índice de eficiência do uso de nitrogênio (g biomassa2/g N-1) nos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IAC95-5000 tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle)...................................................32 Tabela 3 - Número de bactérias (UFC 105 g-1) nas raízes dos genótipos IACSP94-2094 e IACSP95-5000 mantidos em condição hidratada (H) ou restrição hídrica (RH), tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle), em três meios de cultura (JNFb, LGIP, JMV). Contagem realizada no final do segundo experimento................................................................................34 Tabela 4 – Clorofila total nos dois genótipos de cana-de-açúcar mantidos hidratados (H) ou sob restrição hídrica (RH) tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculo A e B) ou não (controle)..........................................................................39 Tabela 5 – Respiração nos dois genótipos de cana-de-açúcar mantidos hidratados (H) ou sob restrição hídrica (RH) tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle)............................................................................................42 Tabela 6 – Teores de nitrogênio (g kg -1) nos dois genótipos de cana-de-açúcar IACSP942094 e IACSP95-5000 tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle), mantidos hidratados (H) ou sob restrição hídrica (RH)........................................................................................................................44 Tabela 7 – Quantidade de nitrogênio acumulado (mg N planta-1) nos dois genótipos de canade-açúcar IACSP94-2094 e IACSP95-5000 tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle), mantidos hidratados (H) ou sob restrição hídrica (RH).............................................................................................46 Tabela 8 – Índice de eficiência de utilização de nitrogênio (g biomassa2/g nutriente-1) nos dois genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP95-5000 tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle), mantidos hidratados (H) ou sob restrição hídrica (RH).........................................................46 xi LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Massa de matéria seca da parte aérea (a) e de raiz (b) dos genótipos IACSP942094 e IACSP95-5000 tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle). Cada histograma representa o valor médio (n=5) ± desvio-padrão. Letras iguais indicam ausência de diferenças estatísticas significativas entre os tratamentos bacterianos dentro do mesmo genótipo pelo teste de Tukey (p>0,05)..........................................................................................26 Figura 2 – Potencial da água na folha (Ψw, MPa) nos genótipos de cana-de-açúcar IACSP942094 e IACSP95-5000 tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculo A e B) ou não (controle), medido às 12h30min. Cada histograma representa o valor médio (n=3) ± desvio-padrão. Letras distintas indicam diferenças estatísticas significativas entre os tratamentos bacterianos dentro do mesmo genótipo pelo teste de Tukey (p<0,05)..........................................................................................27 Figura 3 – Teor de prolina em dois genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP955000 tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle). Cada histograma representa o valor médio (n=3) ± desvio-padrão. Letras distintas indicam diferenças estatísticas significativas entre os tratamentos bacterianos dentro do mesmo genótipo pelo teste de Tukey (p<0,05)...................28 Figura 4 – Transporte aparente de elétrons (ETR) dos genótipos de cana-de-açúcar IACSP942094 e IACSP95-5000 tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle) medido às 13 horas. Cada histograma representa o valor médio (n=3) ± desvio-padrão. Letras distintas indicam diferenças estatísticas significativas entre os tratamentos bacterianos dentro de genótipo pelo teste de Tukey (p<0,05).......................................................................................................29 Figura 5 – Assimilação de CO 2 (A-a), condutância estomática (gs-b) e transpiração (E-d) dos genótipos IACSP94-2094 e IACSP95-5000 tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle) medidos às 13 horas. Cada histograma representa o valor médio (n=4) ± desvio-padrão. Letras distintas indicam diferenças estatísticas significativas pelo teste de Tukey (p<0,05)..........30 Figura 6 – Teor de carboidratos: sacarose (SAC) (a), açúcares solúveis totais (AST) (b) nos genótipos IACSP94-2094 e IACSP95-5000 tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle). Cada histograma representa o valor médio (n=4) ± desvio-padrão. Letras distintas indicam diferenças significativas entre os tratamentos bacterianos dentro do genótipo pelo teste de Tukey (p<0,05).......................................................................................................31 Figura 7 – Atividade das enzimas redutase do nitrato (a) e sintetase da gutamina (b) dos genótipos IACSP94-2094 e IACSP95-5000 tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle). Letras distintas indicam diferenças significativas entre os tratamentos bacterianos dentro do genótipo pelo teste de Tukey (p<0,05)..........................................................................................33 Figura 8 – Massa de matéria seca da parte aérea dos genótipos IACSP94-2094 (a,c) e IACSP95-5000 (b,d) tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A xii e B) ou não (controle), mantidos hidratados (H) ou sob restrição hídrica (RH). Cada histograma representa o valor médio (n=5) ± desvio-padrão. Letras maiúsculas distintas indicam diferenças significativas entre condições hídricas dentro do mesmo tratamento bacteriano. Letras minúsculas distintas indicam diferenças significativas entre os tratamentos bacterianos dentro do mesmo genótipo pelo teste de Tukey (p<0,05)...................................................................35 Figura 9 – Potencial da água na folha (MPa) medido às 12h 30 min. nos genótipos de canade-açúcar IACSP94-2094 (a) e IACSP95-5000 (b) tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle), mantidos hidratados (H) ou em restrição hídrica (RH). Cada histograma representa o valor médio (n=3) ± desvio-padrão. Letras maiúsculas distintas indicam diferenças significativas entre condições hídricas dentro do mesmo tratamento bacteriano. Letras minúsculas distintas indicam diferenças significativas entre os tratamentos bacterianos dentro da mesma condição hídrica pelo teste de Tukey (p<0,05).......36 Figura 10 – Conteúdo relativo de água nos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 (a) e IACSP95-5000 (b) tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle), mantidos hidratados (H) ou sob restrição hídrica (RH). Cada histograma representa o valor médio (n=5) ± desvio-padrão. Letras maiúsculas distintas indicam diferenças significativas entre condições hídricas dentro do mesmo tratamento bacteriano. Letras minúsculas iguais indicam ausência de diferenças significativas entre os tratamentos bacterianos dentro da mesma condição hídrica pelo teste de Tukey (p>0,05)......................................................37 Figura 11 – Teores de prolina nos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 (a) e IACSP95-5000 (b) tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle), mantidos hidratados (H) ou sob restrição hídrica (RH). Cada histograma representa o valor médio (n=3) ± desvio-padrão. Letras maiúsculas distintas indicam diferenças significativas entre condições hídricas dentro do mesmo tratamento bacteriano. Letras minúsculas distintas indicam diferenças significativas entre os tratamentos bacterianos dentro da mesma condição hídrica pelo teste de Tukey (p<0,05)..................................................................................37 Figura 12 – Teores de aminoácidos livres totais (ALT) nos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 (a) e IACSP95-5000 (b) tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle) mantidos hidratados (H) ou sob restrição hídrica (RH). Cada histograma representa o valor médio (n=4) ± desviopadrão. Letras maiúsculas distintas indicam diferenças significativas entre condições hídricas dentro do mesmo tratamento bacteriano. Letras minúsculas distintas indicam diferenças significativas entre os tratamentos bacterianos dentro da mesma condição hídrica pelo teste de Tukey (p<0,05).....................................38 Figura 13 – Assimilação de CO 2 (A-a,b), condutância estomática (gs-c,d), concentração intercelular de CO 2 (Ci-e,f) de plantas dos genótipos IACSP94-2094 (a,c,e) e IACSP95-5000 (b,d,f) tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle), mantido hidratados (H) ou sob restrição hídrica (RH) medidos às 13 horas. Cada histograma representa o valor médio (n=3) ± desviopadrão. Letras maiúsculas distintas indicam diferenças significativas entre condições hídricas dentro do mesmo tratamento bacteriano e genótipo. Letras xiii minúsculas distintas indicam diferenças significativas entre os tratamentos bacterianos dentro da mesma condição hídrica e genótipo pelo teste de Tukey (p<0,05)..................................................................................................................40 Figura 14 – Transpiração (E) de plantas dos genótipos IACSP94-2094 (a) e IACSP95-5000 (b) tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle) mantidos hidratados (H) ou sob restrição hídrica (RH) medida às 13 horas. Cada histograma representa o valor médio (n=3) ± desvio-padrão. Letras maiúsculas distintas indicam diferenças significativas entre condições hídricas dentro do mesmo tratamento bacteriano e genótipo. Letras minúsculas iguais indicam ausência de diferenças significativas entre os tratamentos bacterianos dentro da mesma condição hídrica e genótipo pelo teste de Tukey (p<0,05)........41 Figura 15 – Teores de açúcares solúveis totais (AST) nos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 (a) e IACSP95-5000 (b) tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle) mantidos hidratados (H) ou sob restrição hídrica (RH). Cada histograma representa o valor médio (n=4) ± desviopadrão. Letras maiúsculas distintas indicam diferenças significativas entre condições hídricas dentro do mesmo tratamento bacteriano. Letras minúsculas distintas indicam diferenças significativas entre os tratamentos bacterianos dentro da mesma condição hídrica pelo teste de Tukey (p<0,05).....................................42 Figura 16 – Teor de sacarose (SAC) nos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 (a) e IACSP95-5000 (b) tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle) mantidos hidratados (H) ou sob restrição hídrica (RH). Cada histograma representa o valor médio (n=4) ± desvio-padrão. Letras maiúsculas distintas indicam diferenças significativas entre condições hídricas dentro do mesmo tratamento bacteriano. Letras minúsculas distintas indicam diferenças significativas entre os tratamentos bacterianos dentro da mesma condição hídrica pelo teste de Tukey (p<0,05)..................................................................................43 Figura 17 – Teores de amido (AMI) nos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 (a) e IAC95-5000 (b) tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle) mantidos hidratados (H) ou sob restrição hídrica (RH). Cada histograma representa o valor médio (n=4) ± desvio-padrão. Letras maiúsculas distintas indicam diferenças significativas entre condições hídricas dentro do mesmo tratamento bacteriano. Letras minúsculas distintas indicam diferenças significativas entre os tratamentos bacterianos dentro da mesma condição hídrica pelo teste de Tukey (p<0,05)..................................................................................44 Figura 18 – Atividade da redutase do nitrato (RN) nos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 (a) e IACSP95-5000 (b) tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle) mantidos hidratados (H) ou sob restrição hídrica (RH). Cada histograma representa o valor médio (n=3) ± desviopadrão. Letras maiúsculas distintas indicam diferenças significativas entre condições hídricas dentro do mesmo tratamento bacteriano. Letras minúsculas distintas indicam diferenças significativas entre os tratamentos bacterianos dentro da mesma condição hídrica pelo teste de Tukey (p<0,05).....................................45 xiv Figura 19 – Atividade da sintetase da glutamina (SG) nos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP95-5000 tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle) mantidos hidratados (H) ou sob restrição hídrica (RH). Cada histograma representa o valor médio (n=3) ± desvio padrão. Letras maiúsculas distintas indicam diferenças significativas entre condições hídricas dentro do mesmo tratamento bacteriano. Letras minúsculas distintas indicam diferenças significativas entre os tratamentos bacterianos dentro da mesma condição hídrica pelo teste de Tukey (p<0,05)..........................................48 Figura 20 – Representação das respostas fisiológicas dos genótipos IACSP94-2094 (a) e IACSP95-5000 (b) com boa disponibilidade hídrica, tratados com inóculo A (quadrado) e inóculo B (triangulo) em relação aos respectivos controles (linha pontilhada). Os valores referem-se a mudanças relativas das seguintes variáveis: massa de matéria seca da parte aérea (MSPA), massa seca de raiz (MSR), fotossíntese (A), condutância estomática (gs), transpiração (E), transporte aparente de elétrons (ETR), coeficiente de extinção fotoquímica (NPQ), potencial hídrico (Ψw), teor de sacarose (Sac), teor de açúcares solúveis totais (AST), teor de nitrogênio (N), atividade da redutase do nitrato (RN), atividade da sintetase da glutamina (SG), teor de prolina (Prolina), teor de aminoácidos livres totais (ALT). * indicam diferença estatística em relação ao controle..........................................51 xv Influência de bactérias endofíticas na fisiologia de plantas de cana-de-açúcar sob restrição hídrica RESUMO O estresse hídrico é a principal causa de perdas agrícolas e o uso de novas tecnologias pode melhorar o desenvolvimento de plantas submetidas a esse estresse. A utilização de bactérias endofíticas capazes de promover alterações fisiológicas nas plantas é uma possibilidade a ser examinada como nova tecnologia no cultivo da cana-de-açúcar. Desta forma, buscou-se estudar se a interação planta-bactérias diazotróficas endofíticas seria benéfica em condições de disponibilidade hídrica adequada, e se esta interação poderia reduzir a suscetibilidade das plantas de cana-de-açúcar à restrição hídrica. Foram utilizados dois genótipos um tolerante IACSP94-2094 e outro sensível IACSP95-5000 tratados com inóculos bacterianos (A ou B) ou não (controle) em dois experimentos. Os inóculos bacterianos foram formulados a partir de seleção de isolados bacterianos em meio semiseletivo para Herbaspirillum (A) e para Glucanoacetobacter (B). No primeiro experimento, realizado em condição hídrica adequada, houve aumento da fotossíntese em plantas tolerantes tratadas com os inóculo B, por terem aumento no transporte de elétrons, e em plantas sensíveis o aumento da fotossíntese ocorreu no tratamento com inóculo A, por terem maior abertura estomática. Ainda no primeiro experimento ocorreu aumento na atividade da redutase do nitrato em IACSP95-5000 com o emprego do inóculo B. A interação plantabactérias endofíticas influenciou positivamente as trocas gasosas e o metabolismo do nitrogênio, sem, entretanto, refletir em promoção de crescimento. No segundo experimento, as plantas foram cultivadas sob restrição hídrica e plantas do genótipo sensível não tiveram diminuição da massa de matéria seca quando tratadas com inóculo B. O tratamento com esse inóculo ainda garantiu maior eficiência do uso do nitrogênio sob condição de restrição hídrica. A influência da inoculação de bactérias endofíticas na atenuação dos efeitos da seca foi mais evidente no genótipo sensível (IACSP95-5000). Palavras chave: estresse abiótico, interação planta-bacteria, atenuação de efeitos da seca, fotossíntese, nitrogênio. xvi Influence of endophytic bacteria in the physiology of sugar cane plants under water restriction ABSTRACT Water stress is the main cause of agricultural losses, and the use of new technologies can improve the development of plants under such stress. The use of endophytic bacteria that is capable of promoting physiological changes in plants is a possibility to be examined as new technology in the cultivation of cane sugar. Thus, we sought to study if the interaction plantbacteria would be beneficial in conditions of adequate water availability, and whether this interaction could promote more benefits to plants under water stress and drought sensitive genotype. For this we used tolerant genotype IACSP94-2094 and sensitive IACSP95-5000 treated with bacterial inocula (A or B) or not (control) in two experiments. The bacterial inocula were formulated from the selection of bacterial isolates in semi-selective for Herbaspirillum (A) and Glucanoacetobacter (B). In the first experiment, conducted in proper water conditions, photosynthesis increased in tolerant genotype plants treated with inoculum B, because of the increase in electron transport; and in sensitive plants the increase of photosynthesis occurred in the treatment with the inoculums A, by a more open stomata. Also in the first experiment there was an increase in the activity of nitrate reductase in IACSP95-5000 with the use of inoculums B. The plant-endophytic bacteria positively influenced gas exchange and nitrogen metabolism, without however, reflected in growth promotion. In the second experiment, plants were grown under water stress and plant genotype had no appreciable decrease in dry weight when inoculated with B. Treatment with this inoculum has ensured greater nitrogen use efficiency under water stress condition. The influence of inoculation of endophytic bacteria in mitigating the effects of drought was most evident in the sensitive genotype (IACSP95-5000). Keywords: abiotic stress, plant photosynthesis, nitrogen. bacteria interaction, attenuation effects of drought, xvii 1 INTRODUÇÃO A importância da cana-de-açúcar para o Brasil é inquestionável, desde os tempos coloniais até o presente. Atualmente o país se destaca pela produção não só de açúcar, mas também de etanol, combustível que ganhou relevância na década de 70 com o Proálcool e que atualmente tem grande espaço no mercado devido ao sucesso dos carros bi-combustíveis. Para abastecer o mercado de forma adequada, a produção e a produtividade da cultura precisam aumentar rapidamente. O aumento da produtividade pode ser atingido por meio de melhorias das questões fitotécnicas ou da ocupação de novas áreas, muitas vezes localizadas em ambientes restritivos à produção canavieira. No Estado de São Paulo, a expansão do cultivo da cana-de-açúcar está ocorrendo sobre áreas que apresentam restrições hídricas moderadas (BRUNINI, 2007) e que podem prejudicar o cultivo. O estresse hídrico é a principal causa de perdas agrícolas e entender como as plantas respondem a essa alteração ambiental é importante para traçar estratégias e evitar prejuízos. A falta de água causa uma série de alterações morfo-fisiológicas como: diminuição da área foliar, do turgor celular, do conteúdo relativo de água (CRA), do potencial hídrico foliar, a absorção de nutrientes é alterada, além de grandes alterações no metabolismo do nitrogênio e do carbono (FAROOQ et al., 2009). Uma das primeiras respostas das plantas à seca é o fechamento estomático (CHAVES, 1991), causando uma limitação de substrato para a fotossíntese. A diminuição de CO 2 acarreta menor assimilação de carbono, mas este não é o único fator limitante, já que pode ocorrer também alteração metabólica do processo fotossintético (LAWLOR, 2002; FLEXAS & MEDRANO, 2002). Em cana-de-açúcar, essas alterações metabólicas na fotossíntese parecem acontecer a partir de um potencial hídrico foliar de -0,37 MPa (DU et al., 1996). Estudos que considerem as respostas fisiológicas dos genótipos a condições restritivas podem auxiliar programas de melhoramento genético. A melhoria dos cultivos em condições de estresse também pode ocorrer com a utilização de tecnologias como a aplicação de bactérias capazes de promover crescimento vegetal ou alterações fisiológicas benéficas às plantas. Um exemplo interessante ligado à melhoria da capacidade fotossintética foi apresentado por SHI et al. (2010), no qual o tratamento com bactérias endofíticas causou às plantas de beterraba maior eficiência fotossintética, maior conteúdo de clorofila, além de aumento no teor de carboidratos. 1 A interação entre plantas e bactérias promotoras de crescimento vegetal é bastante conhecida. Essas bactérias podem influenciar diretamente o metabolismo das plantas, fornecendo substâncias que normalmente estariam em menor quantidade, pela absorção de nutrientes ou ainda pelo biocontrole de patógenos como, por exemplo, pela indução de resistência sistêmica (BASHAN & DE-BASHAN, 2005). A fixação biológica de nitrogênio (FBN) é uma das vantagens da associação entre bactérias e plantas. Variedades brasileiras de cana podem obter pelo menos 40 kg N ha-1 ano1 pela FBN (URQUIAGA et al., 2011). Cerca de 60% a 70% do nitrogênio em cana-de-açúcar é proveniente da FBN segundo URQUIAGA et al. (1992). No entanto, não está claro de que forma ocorreria essa interação. Algumas hipóteses surgem como alternativas considerando que as bactérias são responsáveis por uma melhoria na absorção de nitrogênio (MANTELIN & TOURAINE, 2004). Por auxiliar no desenvolvimento vegetal, promover o crescimento radicular (OLIVEIRA et al., 2002) e melhorar a absorção de nutrientes (BARRETTI et al., 2008 a,b), o uso de inoculantes contendo bactérias poderia beneficiar plantas sob restrição hídrica. A presença de bactérias pode também levar à produção de substâncias osmorreguladoras pela planta e assim atuar de forma sinérgica, colaborando na tolerância à seca (DIMKPA et al. 2009). Trabalhos com inoculação de bactérias mostraram que plantas tratadas possuíam potencial hídrico mais elevado do que as plantas controle sob estresse hídrico (CREUS et al., 1998; 2004), garantindo assim vantagens na regulação do balanço hídrico. A inoculação dessas bactérias em plantas pode ainda aliviar os efeitos negativos causados por estresse, garantindo maior fotossíntese e abertura estomática (HAN & LEE, 2005). O tratamento com bactérias parece ser mais favorável em situação de restrição hídrica. Plantas de arroz tratadas com bactérias apresentaram maior diferença de massa de matéria seca entre raiz de plantas tratadas em relação ao controle sem bactérias em condições de menor disponibilidade de água, enquanto que em situação de boa disponibilidade hídrica essa diferença não foi registrada (YUWONO et al., 2005) Desta forma, buscou-se estudar se a interação planta-bactérias diazotróficas endofíticas seria benéfica em condições de disponibilidade hídrica adequada, e se esta interação poderia reduzir a suscetibilidade das plantas de cana-de-açúcar à restrição hídrica. 2 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Aspectos gerais da cultura da cana-de-açúcar Planta originária da Nova Guiné, a cana-de-açúcar (Saccharum spp.) foi introduzida no Brasil no século XVI e parte da história do país confunde-se com a desta cultura. O Brasil é o maior produtor mundial de açúcar e álcool, com produção de cana-de-açúcar estimada de 623 milhões de toneladas para a safra 2011/2012 (CONAB, 2011). A região Centro-Sul do país concentra cerca de 90% da produção nacional, da qual cerca de 60% está no Estado de São Paulo (CONAB, 2011). Mesmo com essa grande produção, na safra de 2009/2010 houve queda e o principal motivo foi climático. A seca que atingiu a região centro-sul prejudicou o desenvolvimento e a renovação dos canaviais (CONAB, 2011). Assim, a importância econômica do cultivo de cana-de-açúcar revela a necessidade de um contínuo aperfeiçoamento para aumentar sua produtividade, garantir melhores condições de cultivo e reduzir impactos ambientais. A cana-de-açúcar é uma cultura tropical e subtropical que produz grande quantidade de biomassa e requer quantidades substanciais de água e nitrogênio para obter rendimento máximo (WIEDENFELD, 2000). Plantas de metabolismo C4 possuem alta eficiência no uso da radiação (ROBERTSON et al., 1996), alcançando altas taxas fotossintéticas e grande acúmulo de carboidratos (WELBAUM & MEINZER, 1990). O destaque desse grupo de plantas é o sistema de concentração de CO 2 nas folhas que consiste em modificações bioquímicas e estruturais garantindo melhor desempenho fotossintético (GHANNOUM, 2009). Outra característica inerente as plantas C4 é que a fotossíntese é mais competitiva em situações que poderiam favorecer perda de carbono pela fotorrespiração tais como altas temperaturas ou diminuição da disponibilidade de água (LOPES et al., 2011). O grande acúmulo de sacarose em genótipos de cana pode ser alcançado pelo aumento da conversão da energia solar em carboidratos, além da distribuição dos fotoassimilados para os colmos (SINGELS et al., 2005). Colmos maduros são capazes de acumular altas concentrações de sacarose chegando a 650 mM em algumas variedades (WELBAUM & MEINZER, 1990). É sabido que o teor de sacarose dos colmos varia com o tempo de colheita. Ele também varia com a idade da cultura, com os estresses abióticos e com o genótipo. O teor de sacarose é maior no inverno, quando há aumento no armazenamento devido à redução na força do dreno, regulada por temperatura, estresse hídrico e nitrogênio (SINGELS et al., 2005). 3 Dentre as variáveis ambientais que podem afetar os processos de bioconversão de energia na cana-de-açúcar estão a luz (intensidade e quantidade), a concentração de CO 2 , a disponibilidade de água, os nutrientes e a temperatura (RODRIGUES, 1995), sendo o déficit hídrico um dos principais fatores limitantes da produção da cana-de-açúcar. O estudo dos efeitos do estresse hídrico sobre os componentes de produção e sua relação com a produtividade pode ajudar os programas de melhoramento a selecionar genótipos produtivos sob essa condição (SILVA et al., 2008). Segundo a UNICA (União das Indústrias de Cana-de-açúcar), a área cultivada com cana-de-açúcar no Brasil passou de 8 milhões em 2011 (CONAB, 2011), e deve dobrar até 2020 (UNICA, 2008). Esse crescimento é estimulado pela demanda do mercado por etanol, principalmente para abastecer veículos bicombustíveis. O mapeamento da expansão da cultura de cana-de-açúcar (AGUIAR et al., 2009) indicou crescimento de 73% na área disponível para colheita entre as safras 2003/04 e 2008/09. Além disso, as áreas com maior expansão estão localizadas na região oeste do Estado de São Paulo, que também apresentam as menores proporções de extensão territorial ocupada pelo cultivo da cana-de-açúcar. Essas áreas do Estado apresentam restrição hídrica de moderada a alta (BRUNINI, 2007), o que pode desfavorecer o cultivo. Sendo a restrição hídrica uma das principais causas de perdas agrícolas, e diante de um cenário que preconiza o uso eficiente da água, estudos que auxiliem o entendimento das respostas de genótipos em condições restritivas de água são essenciais, em especial os que usam técnicas que possam melhorar o desempenho das plantas e aumentar produtividade em condições adversas. 2.2 Efeitos da deficiência hídrica na fisiologia vegetal A seca como fenômeno meteorológico ocorre quando o balanço hídrico da cultura se torna negativo, quando a entrada de água por precipitação ou irrigação é inferior ao potencial de evapotranspiração (PIMENTEL, 2004). O tempo para a insuficiência de suprimento de água causar reduções de crescimento depende do tipo de planta, da capacidade de retenção de água no solo, das condições atmosféricas, principalmente da diferença de pressão de vapor entre a folha e o ar (DPV) e da temperatura e de fatores que controlam a evapotranspiração (PIMENTEL, 2004). As respostas das plantas à seca são caracterizadas por alterações morfológicas como diminuição da área foliar, reduzida pelo enrolamento das folhas e diminuição do crescimento 4 (PIMENTEL, 2004). Segundo FAROOQ et al. (2009), o estresse hídrico ainda impede a divisão celular, leva à perda de turgor, inibindo o alongamento celular, e há uma série de alterações fisiológicas que impedem o desenvolvimento normal da planta. Estas alterações são: mudanças na razão raiz/parte aérea, nas relações hídricas com diminuição do potencial hídrico (Ψ), no conteúdo relativo de água (CRA) e na absorção de nutrientes; diminuição da fotossíntese, da abertura estomática, da respiração, dos teores de carboidratos, alterações no metabolismo do nitrogênio e aumento da atividade de enzimas ligadas ao estresse oxidativo (CHAVES et al., 2002; PIMENTEL, 2004; FAROOQ et al., 2009). Obviamente, esse impedimento do crescimento irá afetar a produtividade das culturas, fato que torna o estudo das conseqüências e das formas de evitar o déficit hídrico os objetivos de muitos trabalhos. Para PIMENTEL (2004) existem três estádios de resposta à deficiência hídrica. No primeiro (ligeira deficiência hídrica) não ocorre diminuição da transpiração, havendo aumento de fitormônio ácido abscísico (ABA), diminuição da expansão celular e da turgescência. Em seguida, no segundo estádio (deficiência hídrica moderada), a condutância estomática diminui levando à redução das taxas de transpiração e de fotossíntese, além da redução da atividade da redutase do nitrato, da sacarose fosfato sintase e de enzimas ligadas à assimilação fotossintética, aumento do teor de carboidratos solúveis e aminoácidos livres. Já no terceiro estádio (deficiência hídrica severa), a transpiração é mínima, há aumento da atividade de enzimas hidrolíticas, diminuição do teor de amido, de proteínas solúveis e clorofila e aumento de espécies reativas de oxigênio. Dentre essas alterações, o fechamento estomático tem sido identificado como um dos primeiros eventos na resposta das plantas à seca moderada, por controlar a perda de água (CHAVES, 1991). Essa resposta pode estar ligada com a comunicação das raízes com a parte aérea, pois ocorre sinalização da disponibilidade hídrica entre raiz e parte aérea levando a regulação do desenvolvimento da planta quando em restrição hídrica (DAVIES & ZHANG, 1991). A principal mudança que pode indicar essa comunicação ocorre na seiva do xilema com diminuição de cátions, de ânions, do pH, de aminoácidos e aumento de hormônios vegetais, principalmente o ABA. Existe uma relação bastante significativa entre a concentração de ABA e fechamento dos estômatos, sendo que quanto maior a quantidade desse hormônio maior é a limitação da condutância e menor a taxa de transpiração das plantas. Considera-se, então, que o ABA seja um sinal químico relevante no desenvolvimento vegetal em restrição hídrica (DAVIES & ZHANG, 1991). Além disso, o fechamento estomático pode estar ligado com a diminuição do turgor e do potencial hídrico foliar (LAWLOR, 2002), com variações na umidade do ar (FRANKS et al., 1997), ou ainda com o 5 ritmo circadiano da planta (CHAVES et al., 2002). Para YORDANOV (2003), a seca moderada induz as plantas a uma regulação do consumo de água permitindo a manutenção do conteúdo relativo de água dentro de limites em que a capacidade fotossintética e a produtividade sejam pouco afetadas. Se por um lado o fechamento estomático restringe a perda de água, ele também diminui a entrada de CO 2 , substrato para a assimilação de carbono pela fotossíntese. Encontram-se aqui duas formas de se tratar a influência da seca na limitação da fotossíntese. Ocorreria, primeiramente, uma limitação ligada ao fechamento estomático que pode levar a mudanças no metabolismo fotossintético logo no início do processo de desidratação, mas também existem mudanças no metabolismo que acontecem devido ao aumento da intensidade do estresse hídrico. Plantas tolerantes à seca podem controlar a abertura dos estômatos para permitir a fixação de carbono no estresse, assim melhorando a eficiência do uso da água, ou abrindo estômatos rapidamente quando o déficit hídrico acaba (YORDANOV, 2003). Em estudo com genótipos de cana-de-açúcar, MACHADO (2009) demonstrou que um genótipo de cana-deaçúcar em condições de déficit hídrico apresentou fechamento estomático antecipado, o que manteve um melhor balanço hídrico, garantindo posteriormente aos estômatos uma abertura capaz de não afetar tanto a fixação de carbono e, desta forma, manter o crescimento. A limitação metabólica é um processo mais complexo e menos esclarecido, o que tem levado a divergências sobre o assunto. Para CHAVES (1991) e CHAVES et al. (2002) a limitação metabólica só ocorreria após um déficit hídrico prolongado que causaria danos mais severos na planta (CORNIC, 2000); para outros autores, os danos metabólicos iniciariam logo no início do processo de resposta da planta à seca (GHANNOUM et al., 2003). Segundo LAWLOR (2002), a limitação da fotossíntese potencial acontece mais por consequência da menor síntese de ATP pela ATPsintase com o decaimento do conteúdo relativo de água (CRA), do que pela menor concentração de CO 2 . O autor não nega a influência da diminuição de CO 2 , mas os efeitos metabólicos dessa redução seriam menos marcantes. O ATP possui papel vital no metabolismo, desta forma os danos metabólicos causados pela diminuição da quantidade desta molécula energética influenciariam uma série de processos. Uma das moléculas que tem sua quantidade reduzida em condições de estresse é a ribulose-1,5-bisfosfato (RuBP), aceptor primário de CO 2 . Essa diminuição de síntese ou regeneração de RuBP está ligada a falta de ATP, cuja síntese parece ser afetada por inativação progressiva ou perda do fator de acoplamento da enzima ATPsintase, ou pela redução da capacidade do transporte de prótons e elétrons, ou ainda por um gradiente de 6 prótons inadequado no tilacóide (LAWLOR, 2002). A síntese de aminoácidos, proteínas e mesmo a atividade de muitas enzimas nas células dependem diretamente da molécula energética para seu funcionamento adequado. A diminuição da entrada de CO 2 associada a altos níveis de radiação solar, comumente registrados em condições de seca, pode levar ao aumento da suscetibilidade a danos no aparato fotoquímico (YORDANOV, 2003). Em condições ideais de irrigação, a energia luminosa interceptada pela folha é transformada em energia química através da cadeia de transporte de elétrons formando NADPH e ATP, moléculas utilizadas no ciclo de Calvin. A redução na assimilação de carbono pode afetar a via fotoquímica, de modo que durante períodos desfavoráveis para a atividade fotossintética, as plantas têm de lidar com um excedente de energia de excitação. Nesta situação, uma série de eventos é desencadeada no aparato fotossintético em resposta ao estresse luminoso, que pode ser definido como a redução na eficiência de conversão da energia luminosa em energia química, devido ao excesso de energia nos fotossistemas II (MAXWELL & JOHNSON, 2000; MATTOS, 2006). Em condições de deficiência hídrica, pode ocorrer um efeito fotoinibitório devido ao excesso de energia luminosa não convertida em energia química. SILVA et al. (2007) encontraram redução nos valores da eficiência quântica do fotossistema II em tecidos adaptados ao escuro (F V /F M ) em todos os genótipos de cana-de-açúcar estudados sob estresse hídrico, de forma mais acentuada nos genótipos suscetíveis à seca. A redução de F V /F M indica fotoinibição (MAXWELL & JOHNSON, 2000) sendo a habilidade de manter valores altos de F V /F M sob estresse hídrico um indicativo da eficiência do uso da radiação para a atividade fotoquímica e assimilação de carbono. Quanto às causas metabólicas de impedimentos na fotossíntese, por exemplo, a atividade enzimática da ribulose-bisfosfato carboxilase oxigenase (Rubisco) diminui muito em condições de seca (GHANNOUM, 2009). A atividade enzimática decai linearmente com a redução do potencial hídrico, alterações na viscosidade e volume celular alteram a agregação e a desnaturação de proteínas e aumentam a concentração de solutos que podem se tornar tóxicos e deletérios às enzimas (FAROOQ et al., 2009) Apesar da grande parte das respostas de plantas C3 serem semelhantes às de plantas C4, existem algumas diferenças relevantes. Assim como em C3, ocorre em C4 o fechamento estomático devido à diminuição do potencial hídrico foliar, que leva a uma diminuição da concentração intercelular de CO 2 (Ci) e, consequentemente, da fotossíntese. No entanto, essa resposta acontece em estágios iniciais do estresse hídrico (DU et al., 1996). Em estudo com cana-de-açúcar, a limitação estomática aparece primeiramente quando o estresse ainda é 7 moderado (-0,37 MPa). Com o aumento da severidade, o que se observa é uma diminuição das trocas gasosas sendo o Ci encontrado alto. Essa resposta indica a limitação não-estomática da fotossíntese, que é corroborada pela redução no teor de clorofila, de proteínas solúveis totais e na atividade enzimática de fosfoenopiruvato carboxilase (PEPcase) e Rubisco (DU et al. 1996). Segundo PIMENTEL (2004) a desidratação causa alterações nos conteúdos de carboidratos, ocorrendo diminuição de amido, quando em estádio moderado de desidratação, além de aumento de açúcares solúveis pela hidrólise de amido que são então usados na respiração de manutenção. Segundo INMAN-BAMBER & SMITH (2005), a extensibilidade celular é afetada pelo status hídrico foliar e pelos processos bioquímicos influenciados pela falta de água. Plantas de cana parecem ter a extensão foliar afetada a partir de -0,4 MPa (LOPES et al., 2011) e reduzida a praticamente zero quando Ψ for de -1,3 MPa. No entanto, a taxa de extensão foliar é rapidamente recuperada com a reidratação, inclusive podendo superar em crescimento aquelas plantas que não passaram por estresse (INMAN-BAMBER & SMITH, 2005). A diminuição da área foliar é uma estratégia para limitar a transpiração. Folhas jovens de cana-de-açúcar são capazes de se enrolar e reduzir a área foliar projetada e com isso reduzir a radiação recebida. INMAN-BAMBER & SMITH (2005) relatam o enrolamento a partir de um potencial de -1,0 MPa ao meio dia, podendo ser esse considerado com suscetibilidade do genótipo à seca, como também uma estratégia de evitar o estresse. Pela diminuição de crescimento, a relação fonte-dreno é alterada. LOPES et al. (2011) sugerem que os efeitos adversos da seca podem ser evitados quando ocorre uma mudança no padrão de alocação de carbono para permitir a formação de um sistema radicular mais profundo antes de uma limitação de crescimento pela escassez de água. Sob seca pode ocorrer acúmulo de amido nas raízes como estratégia de resistência (FAROOQ et al., 2009). INMANBAMBER & SMITH (2005) sugerem que, em cana-de-açúcar, a síntese de sacarose seria afetada pelo estresse a partir de Ψ -0,9 MPa. Outra alteração citada pelos autores é a alocação da sacarose que, no período de seca, seria armazenada nos colmos ao invés de ser usada no alongamento de folhas e colmos. O estresse hídrico pode ainda causar diminuição na atividade da redutase do nitrato (RN), enzima que catalisa a etapa da redução de nitrato (NO3−) a nitrito (NO2−) na assimilação R do nitrogênio. O metabolismo do nitrogênio, assim como o do carbono, tem grande relevância sobre a produção de fitomassa e na produtividade final das culturas. FOYER et al. (1998), trabalhando com milho, verificaram que a atividade enzimática máxima da RN diminuiu como resultado do estresse hídrico, e que existe uma correlação entre a queda da taxa de 8 assimilação de CO 2 com a da atividade enzimática. A atividade dessa enzima é regulada pela fosforilação/desfosforilação, processo que diminui com a redução de CO 2. Além disso, sob estresse, o substrato NO− 3 diminuiu na célula, o que pode modular a transcrição da enzima, levando à redução de sua atividade (FOYER et al., 1998). Já para CHAVES et al. (2002), algumas mudanças reversíveis no metabolismo como a diminuição da atividade da RN podem contribuir para a manutenção da pressão osmótica em células fotossintéticas pelo aumento do nitrato e diminuição da exportação de carboidratos. Açúcares solúveis, além de serem fontes de carbono para manutenção e recuperação de crescimento (CHAVES, 2002), são também tidos como moléculas osmoticamente ativas, assim como a prolina, a glicina-betaina, os ácidos orgânicos, o cálcio, o potássio e os cloretos. O aumento na concentração dessas moléculas é uma estratégia de proteção, já que esses solutos contribuem para ajuste osmótico, desintoxicação de espécies reativas de oxigênio, estabilização de membranas, e das estruturas de enzimas e de proteínas (FAROOQ et al., 2009). Dentre as moléculas osmorreguladoras, a prolina recebe bastante atenção. Aminoácido que costuma aparecer em maiores concentrações em plantas sob estresse hídrico (MAIA et al., 2007), seu acúmulo ocorre em função de maior síntese, diminuição da sua oxidação, da diminuição na incorporação do aminoácido em proteínas, além do aumento da proteólise (PIMENTEL, 2004). Segundo MOLINARI et al. (2007), o papel como osmorregulador dessa molécula é controverso e a prolina em plantas de cana-de-açúcar se mostrou eficiente na proteção contra estresse oxidativo e não foi mediador de ajustamento osmótico. Os autores verificaram que a prolina contribuiu para eliminar radicais livres e tamponar o potencial redox sob condições de estresse e que as plantas com maior teor de prolina tiveram maior produção de biomassa, indicando que essa molécula pode estar ligada à tolerância ao estresse hídrico com outro papel que não o ajustamento osmótico em cana-de-açúcar. Em cana-de-açúcar ocorre um aumento na concentração de hexoses, sacarose, potássio e aminoácidos, mas aparentemente sem alteração na osmorregulação celular. Esses metabólitos podem aumentar em 30% em folhas durante o estresse. O ajuste osmótico deve ocorrer apenas depois de um estresse hídrico severo (INMAN- BAMBER & SMITH, 2005). 2.3 Interações benéficas entre planta e bactérias endofíticas diazotróficas 9 No solo, existe uma infinidade de espécies de bactérias capazes de viver livremente ou em associação com plantas. Esses e outros organismos são responsáveis por uma série de interferências no solo que garantem a qualidade do mesmo, sendo fundamental para a sustentabilidade agrícola. Desta forma, a relação planta-solo-microrganismos é importante para a produção agrícola. É na rizosfera, definida como região do solo que recebe influência direta das raízes possibilitando proliferação microbiana (CARDOSO & NOGUEIRA, 2007), que se encontra o maior número de rizobactérias promotoras do crescimento de plantas (RPCPs). Segundo GRAY & SMITH (2005), as RPCPs poderiam ser divididas dependendo do grau de proximidade com a raiz e a intimidade da associação, classificando-as como rizobactérias extracelulares, que vivem na rizosfera ou no rizoplano (superfície entre raiz e o solo), as que vivem entre os espaços intercelulares do córtex radicular (endofíticas), e as rizobactérias intracelulares as quais existem dentro das células da raiz, geralmente em estruturas especializadas como os nódulos. Dentro dessa classificação, as bactérias endofíticas são aquelas que vivem no interior da planta, não apenas das raízes, e que podem ser isoladas de tecidos cuja superfície foi desinfestada, e que não causam danos visíveis às plantas (HALLMANN et al., 1997). As bactérias endofíticas podem ainda ser chamadas de “endofíticas promotoras do crescimento de plantas” (TAULÉ et al. 2011). As bactérias endofíticas colonizam as plantas primeiramente se aderindo à superfície das raízes, em seguida com a colonização das raíses laterais com penetração pela epiderme, envolvendo lipopolisacarideos, exopolissacarideos bacterianos, posteriormente ocupando os espaços intercelulares, colonizando também o xilema e parte aérea das plantas (MONTEIRO et al., 2012), ainda podem usar aberturas naturais (estômatos) ou artificiais (ferimentos) para sua entrada (BASHAN & DE-BASHAN, 2005). JAMES et al. (2002) comprovaram esse tipo de colonização de endofíticos com a espécie Herbaspirillum seropedicae que se encontra em coleóptilos, raízes laterais e junções destas com a principal, em espaços intercelulares da raiz, aerênquima e células corticais, com pequena entrada no estelo e no tecido vascular, sendo encontradas colônias no xilema, folhas e caules de arroz. Em experimento com cana-de-açúcar micropropagada, OLIVEIRA et al. (2006) observaram o sucesso na colonização de plantas por inóculos contendo até cinco espécies de bactérias endofíticas, indicando ainda que existe uma dinâmica de competição entre as espécies para dominar o ambiente vegetal. As bactérias promotoras de crescimento podem influenciar as plantas de duas formas, segundo BASHAN & DE-BASHAN (2005). Uma delas, afetando diretamente o metabolismo das plantas por fornecerem substâncias que normalmente estariam pouco disponíveis. Elas 10 podem fixar nitrogênio, solubilizar fósforo e ferro ou produzir hormônios como auxinas, giberelinas, citocininas e etileno. A outra forma de atuação dessas bactérias é o biocontrole de patógenos, promovendo o crescimento de forma indireta por permitir que a planta expresse todo o seu potencial de crescimento, que poderia ser limitado, caso um patógeno estivesse presente (BASHAN & DE-BASHAN, 2005). Bactérias endofíticas podem desencadear um fenômeno conhecido como indução de resistência sistêmica (IRS) fazendo com que a planta evite a entrada de patógenos (RYAN et al., 2007). DIMPKA et al. (2009) fazem referência à proteção cruzada, sendo que genes ativados pelo reconhecimento de rizobactérias pelas plantas, além de ativarem a IRS, podem estar envolvidos nas respostas a estresses abióticos como seca, frio, salinidade. Além dessa proteção, existe o controle de insetos por organismos endofíticos sendo que plantas tratadas com esses microrganismos têm menores índices de herbivoria (AZEVEDO et al., 2000). A maioria dos trabalhos, no entanto, está relacionada aos efeitos diretos das bactérias no metabolismo de plantas. Uma característica importante das bactérias endofíticas é a fixação de nitrogênio atmosférico, diminuindo aplicação de fertilizantes nitrogenados, o que propicia menor utilização desses insumos, cujo uso comumente causa poluição ambiental além de proporcionar economia na aquisição destes adubos. A disponibilidade deste nutriente reflete diretamente no desenvolvimento e no rendimento da cultura da cana-de-açúcar (TRIVELIN & VITTI, 2009). Essas bactérias são capazes de realizar fixação biológica de nitrogênio (FBN) (BARBOSA et al., 2006), o que as denomina diazotróficas, e de viver no interior dos tecidos vegetais (endofítico) sem induzirem uma resposta de defesa à sua presença. O processo de FBN é muito importante no Brasil onde existem áreas plantadas de cana-de-açúcar produzindo razoavelmente com aplicações mínimas de fertilizante nitrogenado (BODDEY et al., 1992). OLIVEIRA et al. (2003) relataram que os melhores resultados quanto à contribuição da FBN foram observados em solo de menor fertilidade, indicando que as bactérias contribuem mais para o aumento no conteúdo de nitrogênio quando em condições restritivas. Essas bactérias não são capazes de suprir totalmente a demanda de N das plantas somente pela FBN, porém, podem influenciar fortemente a nutrição nitrogenada das culturas as quais estão associadas, aumentando a capacidade de assimilação de N, indiretamente, com o aumento do sistema radicular, ou diretamente, estimulando o sistema de transporte de N nas plantas (MANTELIN & TOURAINE, 2004). Em relação à classificação quanto à localização, BALDANI et al. (1997) sugeriram três categorias para bactérias fixadoras de nitrogênio que colonizam gramíneas: 1- os 11 organismos rizosféricos; 2- os endofíticos facultativos (capazes de viver na rizosfera ou em vida livre); 3- os endofíticos obrigatórios (incapazes de viver no solo). Estudos com inoculação de microrganismos diazotróficos mostram que bactérias endofíticas contribuem mais com a FBN, além de haver influência de genótipos na relação planta/bactéria (BALDANI & BALDANI, 2005). Os melhores resultados na FBN por organismos endofíticos estão ligados, provavelmente, à sua localização, por estarem próximos à fonte de energia disponibilizada pelas plantas, como a sacarose (BALDANI & BALDANI, 2005), e porque o interior vegetal garante uma baixa pressão de oxigênio que é ideal para a atividade da nitrogenase (BALDANI & BALDANI, 2005). A enzima nitrogenase (responsável pelo processo) funciona em sistemas anaeróbios, aeróbios facultativos e microaeróbios, sendo que a concentração de O 2 deve estar em um nível aceitável para que não cause inibição da atividade enzimática, mas que garanta a respiração celular e a produção de ATP. A FBN necessita de muita energia, cerca de 16 a 30 moléculas de ATP para cada molécula de NH 3 produzida (BURRIS, 1991). O nitrogênio (N 2 ) é reduzido pela nitrogenase em amônia e esta é considerada como a provável forma de fornecimento de nitrogênio às plantas (DONATO et al., 2004). A amônia é então metabolizada pela via GS-GOGAT. A enzima sintetase da glutamina (SG) catalisa a reação transformando glutamato e amônia em glutamina com uso de ATP. Posteriormente, a glutamina é reduzida pela glutamato sintase (GOGAT) a glutamato, aminoácido que também já pode ser usado pela célula (REIS & TEIXEIRA, 2005). No entanto, ainda existem especulações sobre a forma como as bactérias auxiliam a garantir o suprimento de nitrogênio − para plantas. A RN é uma enzima que catalisa a reação de nitrato (NO− 3 ) para nitrito (NO2 ) e esse, por sua vez, é transformado em amônio que entra então nas reações do ciclo GS- GOGAT. Existe ainda a idéia de que a contribuição das bactérias endofíticas para o aumento do conteúdo de nitrogênio seria pelo aumento da absorção de nitrato pelas raízes, o que aumentaria a atividade da RN (BALDANI & BALDANI, 2005). Os gêneros de bactérias endofíticas freqüentemente encontrados associados à cultura da cana-de-açúcar são Herbaspirillum, Burkholderia, Gluconocetobacter, Azospirillum (CAVALCANTE & DOBEREINER, 1988), mas não são os únicos, e nem exclusivos desta cultura. O estudo da interação entre esses gêneros de bactérias e os genótipos de cana pode fornecer subsídios para o aumento de produção e manejo desta cultura. OLIVEIRA et al. (2002) obtiveram resultados que indicaram um aumento nos teores de N com contribuição da FBN em até 30% em cana-de-açúcar inoculada com mistura de cinco espécies de bactérias dos gêneros citados acima. MOREIRA et al. (2010) relataram uma contribuição de 25 a 50 kg 12 de N/ha/ano fixado em gramíneas, equivalente a 17% da demanda dessas culturas. URQUIAGA et al. (1992) demonstraram que 60% a 70% do N acumulado em algumas variedades de cana-de-açúcar foram provenientes da FBN. Em relação à nutrição de plantas tratadas com bactérias endofíticas, BARRETTI et al. (2008a) em trabalho com tomateiros, relataram o aumento na eficiência nutricional com plantas apresentando maiores teores de nutrientes na parte aérea e raiz. A melhoria na qualidade nutricional acaba por proporcionar maior crescimento. Em outro trabalho do mesmo grupo é relatado aumento de crescimento, área foliar, número de folhas e massa da parte aérea e raiz (BARRETTI et al., 2008b). Em cana-de-açúcar já foram registrados aumentos na massa fresca de colmos, na massa de matéria seca de raiz (OLIVEIRA et al., 2002) e até aumento na produtividade dessa cultura (OLIVEIRA et al., 2006) em plantas tratadas com bactérias endofíticas. A maior produção de matéria seca em plantas tratadas com bactérias indica um possível estímulo da fotossíntese. Apesar dessa relação, não são muitos os trabalhos que abordam esse aspecto da interação planta-bactéria, menor ainda é o número de trabalhos com bactérias endofíticas. SHI et al. (2010) relatam que plantas de beterraba tratadas com bactérias endofíticas apresentaram maiores valores de eficiência quântica potencial do fotossistema II (F V /F M ), maior fotossíntese e, esses resultados seriam devido ao melhor transporte de elétrons na membrana do tilacóide, além do aumento do conteúdo de clorofila nas folhas de plantas tratadas, levando a um aumento no teor de carboidratos e uma possível correlação com produção de fitormônios pelas bactérias. A produção de fitormônios como ácido indol acético (AIA), citocininas, giberelinas e ABA por bactérias podem alterar o padrão e o crescimento das plantas, interferindo no seu desenvolvimento (TSAVKELOVA et al., 2006a). A maioria das associações entre bactéria e raízes que mostra efeitos promotores do crescimento em plantas tem sido relacionada com a produção de indóis (AIA), e a inoculação de várias espécies de bactérias resultou no crescimento da raiz e/ou no aumento da formação de raízes laterais. A promoção do crescimento resulta em um aumento da superfície de absorção e pode, por conseqüência, ter efeitos positivos na aquisição de água e nutrientes (DIMKPA et al., 2009). BOIERO et al. (2007) consideram que estirpes produtoras de AIA em grandes quantidades podem ser fontes naturais de hormônios promotores de crescimento, eliminando a necessidade de fontes sintéticas. Hormônios como etileno e ABA estão relacionados a estresses ambientais e podem ser regulados ou produzidos por bactérias em associação com plantas. O etileno produzido em 13 situação de estresse afeta o crescimento radicular e, consequentemente, da parte aérea. Bactérias que possuem a enzima aminociclopropano-1-carboxilase deaminase (ACC deaminase) podem regular a produção desse hormônio sendo vantajoso para o crescimento sob condições de estresse (SALEEM et al., 2007). O ABA, também relacionado a sinais antiestresses, principalmente estresse hídrico, estimula o fechamento dos estômatos (HARTUNG & SLOVIK 1991). Bactérias podem induzir ou ser mediadoras de tolerância a estresses abióticos como salinidade, seca, inundações, temperaturas muito altas ou baixas, deficiência de nutrientes e metais tóxicos (DIMKPA et al., 2009). Bactérias podem ainda produzir substâncias osmotolerantes, como, por exemplo, glicina-betaína que pode atuar sinergicamente com os outros compostos vegetais na redução do potencial hídrico das células, ajudando na tolerância à seca (DIMKPA et al. 2009). A produção de prolina pode ser estimulada nas plantas em presença de bactérias em resposta a estresses bióticos e abióticos, pode mediar o ajuste osmótico, e proteger membranas e proteínas contra efeitos adversos do aumento da concentração de íons inorgânicos (GROVER et al., 2011). Interessante falar que a percepção de um estresse abiótico pela planta pode levar a uma proteção cruzada de outro estresse. Por exemplo, o aumento da síntese de aminas quaternárias como glicina-betaína, aumenta a resistência a deficiência hídrica, mas também protege a planta contra frio e salinidade (DIMKPA et al., 2009). BARKA et al. (2006) mostraram que plantas tratadas com uma estirpe de Burkholderia phytofimans tiveram aumento nos teores de prolina, amido e compostos fenólicos e aumento de resistência ao frio. Usando plantas transgênicas carregando o gene derivado de Bacillus subtillis em Arabidopsis thaliana, verificou-se que houve um aumento nos níveis de prolina levando a um aumento da tolerância a estresses osmóticos (CHEN et al., 2007). Bactérias osmotolerantes, capazes de sintetizar solutos ou osmólitos que aumentam a osmolaridade citoplasmática e conferem estabilidade osmótica às células, são usadas como inoculantes em plantas e parecem também influenciar positivamente as plantas em condições de estresse hídrico (YUWONO et al., 2005). Essas bactérias são capazes de promover crescimento em massa de matéria seca de raiz e parte aérea em plantas de arroz submetidas a estresse hídrico com efeitos mais significativos entre plantas tratadas e controle em condições hídricas mais severas (YUWONO et al., 2005). CREUS et al. (2004), em trabalho com plantas de trigo inoculadas com Azospirillum, relataram que plantas tratadas possuem maior hidratação, potencial hídrico e fração de água apoplástica maiores do que plantas controle em condições de estresse, podendo ocorrer o 14 ajustamento elástico da parede para manutenção de status hídrico favorável em plantas tratadas. A produtividade de trigo, quando em condições de restrição hídrica, foi menos afetada e houve maior conteúdo de Mg, K e Ca nos grãos em plantas tratadas com as bactérias do que plantas controle (CREUS et al., 2004). Para DIMKPA et al. (2009), bactérias podem intermediar mudanças na elasticidade das paredes das células radiculares, o que seria um dos primeiros passos para melhorar a tolerância ao estresse hídrico. Bactérias também podem auxiliar na recuperação após o estresse hídrico, mesmo não evitando perda de água durante o estresse, podendo fazer com que os níveis de água na célula retornem mais rapidamente ao normal (MAYAK et al., 2004). Em plantas tratadas com bactérias em situação de estresse, MAYAK et al. (2004) encontraram estimulo de crescimento. Já LIDDYCOAT et al. (2009) observaram crescimento diferencial dependendo do genótipo de aspargo, para um deles o crescimento foi favorecido pela presença de bactérias apenas sob condições ideais de irrigação, enquanto que para outro genótipo o favorecimento ocorreu em situação de estresse hídrico. Os autores demonstraram assim uma resposta diferencial da interação entre bactéria e planta, associada à condição hídrica. Baseada neste contexto, a interação entre bactérias endofíticas diazotróficas e plantas de cana-de-açúcar submetidas ao déficit hídrico deve ser compreendida para elucidar os aspectos fisiológicos envolvidos nesse complexo sistema biológico. 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Material vegetal e isolados bacterianos Os experimentos foram realizados com dois genótipos de Saccharum spp., o IACSP94-2094 e o IACSP95-5000, tidos como tolerante (LANDELL et al., 2005a, MACHADO et al., 2009) e suscetível (LANDELL et al., 2005b) a condições de restrição hídrica, respectivamente. Foram geradas mudas pela brotação de discos dos colmos contendo gemas em substrato comercial a base de turfa de Sphagno e vermiculita expandida, esterilizado em autoclave a 121°C por uma hora, a 1,5 kgf/cm2. Na ocasião do plantio, os discos de colmos, provenientes de plantas cultivadas em campo no Centro Experimental Central (CEC) do Instituto Agronômico (IAC), contendo gemas maduras foram cortados e colocados em sacos plásticos para realização da inoculação 15 do material vegetal. Para isso, foram selecionados 10 isolados de bactérias endofíticas diazotróficas da coleção da Seção de Microbiologia do Solo, do Centro de Solos e Recursos Ambientais – Instituto Agronômico, Campinas, SP. A origem dos isolados foi a partir de raízes e colmos de plantas cultivadas em solos do Estado de São Paulo. Esses isolados foram selecionados pelos melhores resultados dentre os obtidos em experimento de isolamento e caracterização bacteriana por métodos in vitro, de produção de indóis, redução de acetileno e por testes de desempenho de plantas de cana-de-açúcar em casa de vegetação, que avaliaram a massa seca de raízes e da parte aérea (FREITAS, 2011). Os 10 isolados foram crescidos separadamente em frascos com meio de cultivo líquido Dygs (DÖBEREINER et al.,1995) até a obtenção da concentração de 108 células. No dia do plantio, foram preparados dois inóculos com a mistura de 5 isolados bacterianos cada. O primeiro, denominado inóculo A, composto por 5 isolados provenientes do isolamento em meio de cultivo JNFb (semi–seletivo para Herbaspirillum) (DÖBEREINER et al.,1995), e o segundo, denominado inóculo B, composto pelos isolados provenientes do isolamento em meio LGI-P (semi–seletivo para Gluconoacetobacter diazotrophius) (DÖBEREINER et al.,1995). Amostras de cada material vegetal foram coletadas para quantificação de bactérias endofíticas nativas presentes nos colmos utilizados no plantio (DÖBEREINER et al.,1995). A inoculação foi realizada com a imersão dos discos dos colmos em meio de cultivo com os inóculos (A ou B) ou sem inóculo (Controle), por um período de uma hora antes do plantio. Em seguida, os discos dos colmos foram colocados em copos plásticos de 200 mL com substrato esterilizado. Durante o período de crescimento, as plantas permaneceram em ambiente de telado e foram irrigadas, três vezes por semana, com solução nutritiva com baixo nível de nitrogênio (57 mg L-1) (solução estoque A composta por: 200 g L-1 de Ca(NO 3 ) 2 , 250 g L-1 de CaCl 2 , 20 g L-1 de ConMicros Standart (produto comercial); e solução estoque B composta por 200 g L-1 de KNO 3 , 150 g L-1 de KH 2 PO 4 , 300 g L-1 de MgSO 4 .7H 2 O e 100 g L-1 de KCl por litro: para cada litro de água, a ser usada na irrigação, adicionou-se 2 mL da solução A e 3 mL da solução B). Aos 32 dias após o plantio (DAP), as mudas foram transplantadas para vasos com capacidade de 5 L contendo uma mistura de areia, terra e substrato na proporção 1:1:1 (v/v/v), esterilizada em autoclave a 121°C, por uma hora a 1,5 kgf/cm2. No dia seguinte, foi realizada nova aplicação de inóculos nas plantas, com 10 mL de cada inoculo (A ou B) com concentração de 108 células ou meio de cultura Dygs estéril (controle). Aos 60 DAP, foi realizada uma terceira inoculação da mesma forma como anteriormente descrita. 16 As plantas permaneceram em ambiente telado, com valores médios de temperatura máxima de 37,4 ± 2,8°C, mínima de 18,2 ± 1,5°C e umidade relativa de 73,1 ± 6,8%. Durante os experimentos, foi feita a retirada dos perfilhos, mantendo-se apenas um colmo principal. Foram realizados dois experimentos com as mudas cultivadas: 3.2 Delineamento experimental 3.2.1 Primeiro experimento: desenvolvimento de plantas cana-de-açúcar tratadas com inóculos bacterianos e sob disponibilidade hídrica adequada. As plantas foram mantidas sob boa disponibilidade hídrica em vasos com 80% da capacidade de retenção de água. Aos 71 DAP, foi feita a coleta de 30 plantas, sendo 5 plantas de cada tratamento (inóculo A ou B e controle). O delineamento do primeiro experimento foi inteiramente ao acaso em esquema fatorial simples, sendo as causas de variação: inóculos bacterianos A ou B ou sem inoculação (controle). 3.2.2 Segundo experimento: desenvolvimento de plantas de cana-de-açúcar tratadas com inóculos bacterianos e sob condição de restrição hídrica. As plantas foram submetidas a duas condições hídricas: vasos com 80% (hidratada H) e com 50% (restrição hídrica - RH) da capacidade de retenção, controlado pela massa dos mesmos. As avaliações fisiológicas foram realizadas no 5º dia em que os vasos com suspensão parcial da rega estavam a 50% da capacidade de retenção de água (78 DAP). No dia da coleta as plantas apresentaram folhas amareladas e retorcidas indicando os efeitos do tratamento hídrico. Nessa etapa, foram coletadas 60 plantas para análises laboratoriais posteriores, sendo 5 plantas de cada tratamento bacteriano (inóculo A ou B e controle) em condição hidratada (H) ou restrição hídrica (RH), totalizando 30 plantas de cada genótipo. O delineamento experimental do segundo experimento foi inteiramente ao acaso em esquema fatorial duplo, sendo as causas de variação: as condições hídricas e a inoculação. Nos dois experimentos foram realizadas as avaliações descritas a seguir. 17 3.3 Medidas de crescimento Foram avaliados os números de folhas, a altura das plantas utilizando-se uma trena, e a massa de matéria seca da parte aérea e raízes pela secagem em estufa a 60°C. 3.4 Potencial hídrico e conteúdo relativo de água na folha O potencial hídrico Ψw) ( nas folhas + 3 de cana-de-açúcar foi determinado com o auxílio da câmara de pressão tipo Scholander. Na folha +2, foram extraídos cinco discos para a determinação do conteúdo relativo de água (CRA) (SILVEIRA et al., 2003). Discos foliares de 1 cm de diâmetro foram pesados imediatamente após a coleta, obtendo-se sua massa fresca (MF). Em seguida, foram dispostos em placas de Petri e imersos em água destilada, por sete horas, em temperatura ambiente sob radiação fotossinteticamente ativa de 40 µmol m-2 s-1. Então, os discos foram secos em papel filtro e pesados novamente, obtendo-se a massa túrgida (MT). O material foi seco em estufa a 80°C por 48 horas e pesados novamente, para a obtenção da massa seca (MS). O CRA foi calculado pela equação abaixo: CRA = 3.5 Trocas gasosas MF − MS × 100 MT − MS Foi avaliada a assimilação líquida de CO 2 (A, µmol m-2 s-1), a transpiração (E, mmol m-2 s-1), a condutância estomática (gs, mol m-2 s-1) e a concentração intercelular de CO 2 (Ci, µmol mol-1) nas folhas +1. As medidas foram realizadas com concentração de CO 2 constante (380 µmol mol-1) e sob Q de 1600 µmol m-2 s-1 (semelhante ao do ambiente), às 14 horas. A respiração no escuro (R, µmol m-2 s-1) foi avaliada às 6 horas. As medidas foram realizadas com um analisador portátil de gases a infravermelho, IRGA (Infra Red Gas Analyser) modelo Li-6400 (Licor, EUA), na primeira folha totalmente expandida e com lígula aparente (folha +1), no terço médio do limbo foliar e as medidas foram registradas quando o coeficiente de variação (CV) total foi inferior a 0,5%. 18 3.6 Atividade fotoquímica As medidas da emissão de fluorescência da clorofila a foram realizadas por meio de um fluorômetro modulado (6400-40 LFC) integrado ao Li-6400F. As folhas +1, usadas para medidas de trocas gasosas, foram previamente adaptadas ao escuro por 30 minutos com auxílio de papel alumínio. Em seguida, um pulso de luz saturante foi aplicado e então foi medida a eficiência quântica potencial do fotossistema II (F V /F M ), o coeficiente de extinção não fotoquímica da fluorescência [NPQ=(F M -F M ’)/F M ’] e o transporte aparente de elétrons [ETR=Q x ΔF/F M ’ x 0,5 x 0,84]. 3.7 Conteúdo de clorofilas Os conteúdos foliares de clorofilas a e b e total foram avaliados com um medidor eletrônico de teor de clorofila (ClorofiLOG CFL 1030, Faker- Brasil), nos mesmos dias e folhas avaliadas para as trocas gasosas nas folhas +1. 3.8 Extração de compostos por MCW As amostras de folhas +3 coletadas foram armazenadas em ultrafreezer (-80°C) e posteriormente secas em liofilizador (Labconco – Freezone 4.5) a -50°C e 133x10-3 mbar. Depois de secas, as amostras vegetais foram moídas em moinho marca IKA modelo A 11 basic, e armazenadas em frascos plásticos hermeticamente fechados até o momento das análises. Para extração de açúcares solúveis totais, sacarose, aminoácidos livres totais e prolina, aproximadamente 75 mg de amostra vegetal juntamente com 3 mL de solução de metanol:clorofórmio:água (MCW), na proporção 12:5:3 (v/v/v), segundo BIELESK & TURNER (1966), foram colocados em tubos tipo rosca. A solução foi mantida em geladeira a 5°C, por três dias. Então, acrescentou-se água e clorofórmio na proporção 1:1,5 (v/v), agitando-se os tubos e voltando-os à geladeira por mais 24 horas. Após a separação das fases, coletou-se o sobrenadante (fração aquosa-metanólica) e foi feita a concentração das amostras em banho-maria a 50°C. A solução foi quantificada em proveta (mL) e armazenada em microtubos, em freezer (-20°C). 19 3.9 Teor de carboidratos foliares As análises de carboidratos incluíram açúcares solúveis totais (AST), sacarose (Sac) e amido (AMI). Os AST foram determinados pelo método do fenol-sulfúrico (DUBOIS et al., 1956). Em tubos de ensaio, foram adicionados 10 µL de extrato foliar e 490 µL de água mili-Q, 500 µL de solução de fenol 5% e 2 mL de ácido sulfúrico (H 2 SO 4 ) concentrado. Depois de agitados os tubos até a homogeneidade da solução e posterior resfriamento, foram feitas as leituras de absorbância em espectrofotômetro (Micronal – B342II), no comprimento de onda de 490 nm. As concentrações de sacarose foram calculadas a partir de uma curva-padrão obtida com leituras de solução de glicose contendo concentrações de 0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 e 90 µg/mL. A concentração de Sac foi determinada pelo método descrito por VAN HANDEL (1968) e DUBOIS et al. (1956). Em tubos de ensaio, foram adicionados 10 µL de extrato, 490 µL de água mili-Q e 500 µL de solução de hidróxido de potássio (KOH) 30%. Os tubos foram vedados e levados ao banho-maria a 100 °C, por 10 minutos. Em seguida, adicionaram-se 500 µL de solução de fenol 5% e 2 mL de ácido sulfúrico (H 2 SO 4 ) concentrado. As leituras de absorbância foram feitas em espectrofotômetro no comprimento de onda de 490 nm. As concentrações de sacarose foram calculadas a partir de uma curva-padrão obtida com leituras de solução de sacarose contendo concentrações de 0, 5, 10, 20, 30, 40 e 50 µg/mL. Para a quantificação de AMI, foi utilizado o método descrito por AMARAL et al. (2007). Em microtubos contendo 10 mg de material vegetal seco, foram realizadas quatro extrações com 500 µL de etanol 80%, a 80 °C em banho-maria, por 20 minutos cada, para solubilização de açúcares, pigmentos, fenóis e outras substâncias. O precipitado foi então seco a temperatura ambiente, até a completa evaporação do resíduo de etanol. Em seguida, foram adicionados 500 µL (120 U mL-1) d e α-amilase (EC 3.2.1.1) termoestável de Bacillus licheniformis (cód. E-ANAAM, MEGAZYME, Irlanda), diluída em tampão MOPS 10 mM e pH 6,5. As amostras foram incubadas em banho-maria a 75°C, por 30 minutos. Em seguida, foram adicionados 500 µL (30 U mL-1) de amiloglucosidase (EC 3.2.1.3) de Aspergillus niger (cód. E-AMGPU, MEGAZYME, Irlanda) em tampão acetato de sódio 100 m mol L-1 e pH 4,5. As amostras foram incubadas em banho-maria a 50°C, por 30 minutos. Foram acrescentados 100 µL de ácido perclórico (HClO 4 ) 0,8 mol L-1 para parar a reação e precipitar proteínas. As amostras permaneceram em freezer (-20°C) até o momento da quantificação. 20 Para a quantificação, em microtubos de 1,5 mL, foram colocados 50 µL de amostra e 750 µL de Glicose PAP Liquiform (Labtest Diagnóstica S.A. Brasil). A solução foi encubada em banho-maria a 37°C, por 15 minutos. O conteúdo de glicose foi determinado em leitor de microplacas modelo EL307 (Bio-Tek Instruments, EUA), em comprimento de onda de 490 nm. As concentrações de amido foram calculadas a partir de uma reta-padrão obtida com leituras de solução de glicose contendo concentrações de 0, 5, 10, 15, 25 e 30 µg/mL. Os teor de AST, Sac e AMI foram expressos em mg g-1 de massa seca. 3.10 Teor de prolina A quantificação de prolina foi realizada segundo RENA & MASCIOTTI (1976). Em tubos de ensaio, foram adicionados 100 µL de glicina 0,1M, 300 µL de extrato de MCW, 2,6 mL de água mili-Q, e 2 mL de ácido acético concentrado. Após serem agitados para homogeneizar a solução, foram acrescentados 2 mL de reagente de ninhidrina (600 mg de ninhidrina + 15 mL de ácido acético concentrado + 10 mL de ácido fosfórico (H 3 PO 4 ) 6 mol L-1). Após agitação, a mistura foi encubada em banho-maria a 100°C, por 35 minutos. Em seguida, os tubos foram colocados em banho de gelo para rápido resfriamento da reação e adicionados 4 mL de tolueno concentrado. Agitou-se vigorosamente e a absorbância do sobrenadante (tolueno) foi determinada em espectrofotômetro com o comprimento de onda de 515 nm. A reta-padrão foi obtida com solução de prolina em concentrações de 0, 0,5, 1, 2, 3 e 4 µg/mL. O conteúdo de prolina foi expresso em µmol g-1 de massa seca. 3.11 Teor de aminoácidos livres totais Segundo YEMM & COCKING (1954), foi determinado o conteúdo de aminoácidos solúveis totais nas folhas. Em tubos de ensaio, foram dispensados 50 µL de extrado de MCW, 950 µL de água mili-Q, em seguida 500 µL de tampão citrato 0,2 M (20,5 mL de ácido cítrico 0,2 M e 29,5 mL citrato de sódio 0,2 M misturados até o pH 5), 200 µL de ninhidrina em metilglicol (2,5 g de ninhidrina em 50 mL de etilenoglicol monometiléter a 99%) e 1 mL de solução de KCN (2 mL de KCN 0,01 N em 98 mL de metilglicol). Os tubos foram agitados, vedados e encubados em banho-maria a 100°C, por 20 minutos. Posteriormente, foram resfriados a temperatura ambiente e adicionado 1 mL de etanol 60%. Os tubos foram agitados e as leituras foram feitas em espectrofotômetro com comprimento de onda de 570 nm. A 21 curva padrão foi feita utilizando-se solução de leucina em diferentes concentrações de 0, 20, 40, 60, 80 e 100 nmol/mL. O teor de aminoácidos solúveis totais foi expresso em mg g-1 de massa seca. 3.12 Teor de nitrogênio total em folhas Foi transferido 0,1 g de material vegetal seco e moido para tubos de digestão (tipo Folin-Wu), contendo 1 g de mistura digestora (1000 g de K 2 SO 4 + 100 g de CuSO 4 .5H 2 O + 10 g de Se), 3 mL de ácido sulfúrico concentrado e 1 mL de peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ). Os tubos foram então colocados em um bloco digestor e aquecidos lentamente até a temperatura de 360 ºC, sendo as amostras digeridas ao ponto de ebulição da mistura, até a obtenção de um extrato esverdeado. Após o resfriamento até temperatura ambiente, foram adicionados 5 mL de água mili-Q. O conteúdo de cada tubo foi usado na dosagem de nitrogênio, segundo o método de Kjeldahl (BREMNER, 1965). Para a dosagem, as amostras passaram por processo de destilação. O tubo contendo a amostra foi conectado a destilador e 15 mL de NaOH 10 N foram dispensados para reagir com o conteúdo do tubo. Foi realizada a destilação, a fim de que o nitrogênio contido na amostra fosse volatilizado em forma de amônia e recolhido em erlenmeyer contendo 20 mL de solução de ácido bórico-indicador. A destilação foi interrompida após a produção de 20 mL de destilado. O conteúdo do erlenmeyer foi então titulado, usando solução padronizada de ácido sulfúrico 0,0714 N. O volume de ácido foi utilizado para calcular a quantidade de nitrogênio na amostra. O teor de nitrogênio foi utilizado para calculador a quantidade acumulada (mg de N planta-1) e o índice de eficiência de utilização (g biomassa2/ g nutriente-1). O teor de nitrogênio foi expresso em g kg-1 de massa seca. 3.13 Extração enzimática Para a extração enzimática, seguiu-se o método descrito por SILVEIRA et al. (2010) com adaptações nas concentrações de inibidores de proteases. As amostras de folhas +1 preservadas em freezer -80°C foram pesadas (2,0 g), rapidamente transferidas para almofariz e maceradas com auxílio de nitrogênio líquido e PVPP (Polivinilpolipirrolidona). Acrescentaram-se ao macerado 5 mL de tampão de extração Tris-HCl 100 mM pH 7,5 22 contendo FAD 10 µM + EDTA 20 mM + DTT 5 mM + BSA 0,5% + mistura de inibidores (PMSF 0,1 mM + leuptina 10 µM + benzidina 1 mM). O macerado foi então filtrado em duas camadas de gaze e centrifugado a 10.000 rpm a 4°C, por 20 minutos. O sobrenadante foi recolhido em microtubos de 2,0 mL para posterior quantificação da atividade enzimática. 3.14 Atividade enzimática in vitro da redutase do nitrato Para determinação da atividade da redutase do nitrato, 200 µL de extrato enzimático foram adicionados a 500 µL de tampão de quantificação (Tris-HCl 100 mM pH 7,5 + EDTA 10 mM + KNO 3 5 mM +DTT 5 mM + FAD 10 µM) e 15 µL de NADH 1 mM em microtubos. A reação foi incubada em banho-maria a 30°C, por 30 minutos. Logo após esse período, a reação foi paralisada colocando os microtubos em banho-maria a 100°C, por 10 minutos e posteriormente foi acrescentados 750 µL de sulfanilamida [sulfanilamida 1% + dicloridrato de N-(1-naftil) etilenodiamina] dissolvida em HCl (2,4 N). Para eliminar a turvação, os microtubos foram centrifugados a 13.000 rpm e o sobrenadante contendo o nitrito formado foi quantificado por meio de leitura em espectrofotômetro, com comprimento de onda de 540 nm. Uma curva padrão foi feita utilizando solução de NO− 2 em diferentes concentrações: 15, 37,5, 60, 75, 150 e 225 ng/mL. A atividade foi expressa em nmol NO− 2 g 1 MF h-1. O procedimento utilizado seguiu o descrito por SILVEIRA et al.(2010). 3.15 Atividade enzimática in vitro da sintetase da glutamina Para determinação da atividade da glutamina sintetase, 100 µL de extrato enzimático foram acrescentados a 300 µL de tampão de quantificação (Tris-HCL 50 mM pH 7,0 + MgSO 4 5 mM + hidroxilamina NaOH 100mM + glutamato de Na 50 mM), 100µL de ATP 100 mM. A reação foi incubada em banho-maria a 30°C, por 30 minutos. Logo em seguida, foram adicionados 500 µL de solução férrica (FeCl 3 0,37M + TCA 0,2 M dissolvidos em HCl 0,67M) para paralizar da reação. Para eliminar a turvação, os microtubos foram centrifugados a 13.000 rpm e o sobrenadante foi quantificado por meio de leitura em espectrofotômetro com comprimento de onda de 535 nm. Uma curva padrão foi feita utilizando solução deγ -glutamil-hidroximato (GGH) em diferentes concentrações 0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 µmol/mL. A atividade foi expressa em µmol GGH g-1 MF h-1. O procedimento utilizado seguiu o descrito por SILVEIRA et al. (2010), com adaptações: 23 diminuição na concentração de MgSO 4 e hidroxilamina NaOH e aumento na concentração de ATP. 3.16 Quantificação de bactérias presentes nos colmos e nas raízes No início do primeiro experimento, foi realizada a quantificação de bactérias diazotróficas endofíticas nos colmos utilizados para a produção de mudas. A técnica utilizada foi a descrita em DÖBEREINER et al. (1995). Para isso, foram coletados 10 g de cinco colmos de cada material (IACSP94-2094 e IACSP95-5000), submetidos à desinfecção superficial com álcool 70%, por 30 segundos, seguido de duas lavagens com água destilada esterilizada, e Cloramina T 1% por 30 segundos, seguido de três lavagens com água destilada esterilizada. Os colmos desinfestados foram triturados juntamente com 90 mL de solução de sacarose 4%, em liquidificador, por 1 minuto. A seguir, foram feitas diluições. Com o objetivo de verificar se a inoculação foi eficiente, no final do experimento foi realizada a quantificação de bactérias diazotróficas endofíticas presentes nas raízes das plantas. Foram coletados 10 g de raiz que foram submetidas à desinfecção superficial com Cloramina T 1% por 15 minutos, seguido de três lavagens com água destilada esterilizada e transferidos para uma solução tampão fosfato 0,05 M (pH 7,0) por 15 minutos, seguido de três lavagens com água destilada esterilizada. As raízes desinfestadas foram trituradas juntamente com 90 mL de solução de sacarose 4%, no liquidificador, por 1 minuto e feitas as diluições e as inoculações. As diluições seriadas das amostras foram feitas em solução de sacarose, de 10-2 a 10-6. Utilizou-se 0,1 mL de cada diluição para inoculação no meio semi-sólido para o diazotrófico desejado, ou seja, JMV semi-específico para o gênero Burkholderia (BALDANI, 1996), JNFb para o gênero Herbaspirillum e LGI-P para G. diazotrophius (DÖBEREINER et al.,1995). O crescimento bacteriano foi evidenciado pela presença da película típica logo abaixo da superfície do meio, depois de 7 dias de incubação a 30°C. A comunidade bacteriana foi estimada pela técnica do número mais provável (MPN), consultando a tabela de McCrady para 3 repetições por diluição. 3.17 Delineamento estatístico e análise de dados Os dados foram submetidos à análise de variância e quando as médias apresentaram diferenças significativas, foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. 24 4 RESULTADOS 4.1 Efeitos da interação planta-bactéria na fisiologia de cana-de-açúcar sob disponibilidade hídrica adequada. 4.1.1 Contagem de bactérias endofíticas A contagem de bactérias nos colmos, usados para produção das mudas, indicou número médio, aproximadamente, sete vezes maior de bactérias nativas no genótipo IACSP95-5000, quando comparado com o IACSP94-2094 (Tabela 1). Tabela 1 - Número mais provável (NMP) de bactérias, no início do experimento, nos colmos dos genótipos IACSP94-2094 e IACSP95-5000, utilizados para produção de mudas, em três meios de cultura (JNFb, LGIP, JMV). Genótipos Meios de cultura JMV LGI-P JNFb Média UFC.105 g-1 IACSP94-2094 IACSP95-5000 2,50 6,00 2,0 18,8 5,4 41,3 3,3 22,0 Os valores são descritivos e não aplicado teste estatístico. 4.1.2 Aspectos biométricos Plantas tratadas não diferiram das do controle em relação à altura nos genótipos avaliados, variando de 37 a 39 cm para IACSP94-2094, e 25 a 27 cm para IACSP95-5000. Quanto ao número de folhas, também não houve diferença entre os tratamentos bacterianos e plantas controle, sendo 7,0 o número médio de folhas em cada planta. As massas de matéria seca da parte aérea e das raízes não apresentaram diferenças significativas entre os tratamentos controle, inóculo A ou B (Figura 1). 25 Massa de matéria seca da parte aérea (g) Massa de matéria seca de raiz (g) 12 (a) 10 a a Controle Inóculo A Inóculo B a a 8 a a 6 4 2 0 20 (b) 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 a a a a IACSP94-2094 a a IACSP95-5000 Figura 1 – Massa de matéria seca da parte aérea (a) e de raiz (b) dos genótipos IACSP942094 e IACSP95-5000 tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle). Cada histograma representa o valor médio (n=5) ± desvio-padrão. Letras iguais indicam ausência de diferenças estatísticas significativas entre os tratamentos bacterianos dentro do mesmo genótipo pelo teste de Tukey (p>0,05). 4.1.3 Potencial hídrico e conteúdo relativo de água Plantas tratadas com inóculos apresentaram maior potencial hídrico (Ψw) que plantas controle (Figura 2). Para o genótipo IACSP94-2094, plantas tratadas com o inóculo A registraram maior potencial (Figura 2a), enquanto que para IACSP95-5000 o maior potencial ocorreu em plantas tratadas com o inóculo B (Figura 2b). 26 0,0 IACSP94-2094 IACSP95-5000 -0,1 -0,2 Ψw (MPa) -0,3 a -0,4 a -0,5 -0,6 b -0,7 b -0,8 -0,9 c c Controle Inóculo A Inóculo B Figura 2 – Potencial da água na folha (Ψw, MPa) nos genótipos de cana-de-açúcar IACSP942094 e IACSP95-5000 tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculo A e B) ou não (controle), medido às 12h30min. Cada histograma representa o valor médio (n=3) ± desviopadrão. Letras distintas indicam diferenças estatísticas significativas entre os tratamentos bacterianos dentro do mesmo genótipo pelo teste de Tukey (p<0,05). Plantas IACSP94-2094 tratadas com inóculo B apresentaram maior conteúdo relativo de água (CRA) (91%) que os demais tratamentos, cuja média foi de 85%. Para o genótipo IACSP95-5000, não se observou diferenças significativas entre os tratamentos com uma média de 88%. 4.1.4 Teores de prolina e aminoácidos livres totais Foi possível verificar que as plantas controle, de ambos os genótipos, apresentaram maior conteúdo de prolina que as tratadas com inóculo (A ou B) (Figura 3). Para aminoácidos livres totais (ALT), não houve diferença significativa entre os tratamentos bacterianos, em nenhum dos genótipos, com uma média de 2,5 mg (g MS-1). 27 0,8 Controle Inóculo A Inóculo B a Prolina [µmol (g MS)-1] 0,7 0,6 a 0,5 b b ab 0,4 b 0,3 0,2 0,1 0,0 IACSP94-2094 IACSP95-5000 Figura 3 – Teor de prolina em dois genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP955000 tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle). Cada histograma representa o valor médio (n=3) ± desvio-padrão. Letras distintas indicam diferenças estatísticas significativas entre os tratamentos bacterianos dentro do mesmo genótipo pelo teste de Tukey (p<0,05). 4.1.5 Atividade fotoquímica Quanto à eficiência quântica potencial do fotossistema II (F V /F M ) e coeficiente de extinção não fotoquímica da fluorescência (NPQ) não foram observadas diferenças significavas entre plantas tratadas e controle em ambos os genótipos. F V /F M variou entre 0,753 e 0,777 na medida realizada às 13h. Para NPQ o valor médio para o genótipo IACSP942094 foi de 1,63, e 1,98 para IACSP95-5000. O transporte aparente de elétrons (ETR) em plantas IACSP94-2094 tratadas com inóculo B foi maior do que as plantas controle (Figura 4a), enquanto que para as plantas IACSP95-5000 o ETR foi maior nas plantas controle (Figura 4b). 4.1.6 Clorofila a, b e total Quanto às medidas dos teores relativos clorofila, não foram observadas diferenças significativas entre os tratamentos, sendo as médias de 35 para clorofila a, 13 para clorofila b e 50 para clorofila total no genótipo IACSP94-2094. No genótipo IACSP95-5000, os valores médios foram de 36 para clorofila a, 17 para clorofila b e 53 para clorofila total. 28 ETR (µmol m-2 s-1) 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Controle Inóculo A Inóculo B a ab a b b b IACSP94-2094 IACSP95-5000 Figura 4 – Transporte aparente de elétrons (ETR) dos genótipos de cana-de-açúcar IACSP942094 e IACSP95-5000 tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle) medido às 13 horas. Cada histograma representa o valor médio (n=3) ± desviopadrão. Letras distintas indicam diferenças estatísticas significativas entre os tratamentos bacterianos dentro de genótipo pelo teste de Tukey (p<0,05). 4.1.7 Trocas gasosas Plantas do genótipo IACSP94-2094 tratadas com o inóculo B mostraram maiores valores de fotossíntese, enquanto que o tratamento com inóculo A no genótipo IACSP955000 foi o que promoveu maior estímulo da assimilação de CO 2 (Figura 5a) e maior condutância estomática (Figura 5b). No genótipo IACSP94-2094, não houve diferença entre os tratamentos quanto à condutância estomática (Figura 5b). Os valores de transpiração (E) nas plantas IACSP95-5000 tratadas com inóculo B foram reduzidos em relação ao controle. O genótipo IACSP94-2094 não apresentou diferença significativa (Figura 5d). 29 A(µmol m-2 s-1) gs (mol m-2 s-1) 40 (a) 35 30 25 20 15 10 5 0 0,21 (b) 0,18 0,15 0,12 0,09 0,06 0,03 0,00 12 Controle Inóculo A Inóculo B a a b E (mmol m s ) -1 -2 6 b ab a b a a a b a (c) 10 8 b a a ab b a 4 2 0 IACSP94-2094 IACSP95-5000 Figura 5 – Assimilação de CO 2 (A-a), condutância estomática (gs-b) e transpiração (E-d) dos genótipos IACSP94-2094 e IACSP95-5000 tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle) medidos às 13 horas. Cada histograma representa o valor médio (n=4) ± desvio-padrão. Letras distintas indicam diferenças estatísticas significativas pelo teste de Tukey (p<0,05). 30 Quanto à respiração, as plantas tratadas com inóculos não apresentaram diferença significativa em relação às plantas controle nos genótipos estudados. Para IACSP94-2094 a média foi de 1,41 e 1,91 µmol m-2s-1 para IACSP95-5000, com medidas realizadas às 6 horas. 4.1.8 Carboidratos foliares O teor de sacarose (SAC) para plantas IACSP95-5000 tratadas com inóculo B foi menor do que plantas controle, enquanto que para o genótipo IACSP94-2094 não foram encontradas diferenças significativas (Figura 6a). Plantas IACSP94-2094 tratadas com inóculo B tiveram maiores valores de açucares solúveis totais (AST) (Figura 6b). O teor de amido apresentou diferença entre os tratamentos, ou entre os genótipos, com média em torno de 19 mg Glu (g MS)-1. 30 100 (b) 90 a b b a a 25 20 b 15 10 5 0 AST [mg Glu (g MS-1)] SAC [mg Suc (g MS-1)] 40 (a) 35 80 Controle Inóculo A Inóculo B a ab b a a a 70 60 50 40 30 20 10 IACSP94-2094 IACSP95-5000 0 IACSP94-2094 IACSP95-5000 Figura 6 – Teor de carboidratos: sacarose (SAC) (a), açúcares solúveis totais (AST) (b) nos genótipos IACSP94-2094 e IACSP95-5000 tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle). Cada histograma representa o valor médio (n=4) ± desviopadrão. Letras distintas indicam diferenças significativas entre os tratamentos bacterianos dentro do genótipo pelo teste de Tukey (p<0,05). 4.1.9 Nitrogênio Não houve diferença significativa entre os tratamentos quanto ao teor e quantidade de nitrogênio acumulado nas folhas de cana, com valores médios de 23,0 g kg-1 e 194,0 mg N planta-1, respectivamente para as duas variáveis. As plantas IACSP94-2094 tratadas com o 31 inóculo A apresentaram menor eficiência na utilização do nitrogênio que os demais tratamentos (Tabela 2). Tabela 2 – Índice de eficiência do uso de nitrogênio (g biomassa2/g N-1) nos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IAC95-5000 tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle). Tratamento Controle Inóculo A Inóculo B IACSP94-2094 0,438 ± 0,014 a 0,357 ± 0,034 b 0,427 ± 0,031 a IACSP95-5000 0,339 ± 0,019 a 0,352 ± 0,004 a 0,329 ± 0,016 a Valores referem-se às médias (n=3) ± desvios. Letras distintas indicam diferenças significativas entre tratamentos bacterianos pelo teste de Tukey (p<0,05). 4.1.10 Enzimas do metabolismo do nitrogênio A atividade da enzima redutase do nitrato em plantas IACSP95-5000 tratadas com inóculo B foi maior do que nas plantas do controle, sendo que o tratamento com inóculo B promove maior atividade da enzima que com o inóculo A (Figura 7a). A atividade da sintetase da glutamina nas plantas desse genótipo não foi influenciada pelos tratamentos bacterianos (Figura 7b). Nas plantas do genótipo IACSP94-2094, os tratamentos bacterianos não causaram diferenças significativas nas atividades da redutase do nitrato e sintetase da glutamina (Figura 9a, b). 32 Atividade da RN (nmol NO2 gMF-1 h-1) 30 25 20 a 15 a a a b c 10 5 0 6 Atividade da SG (µmol GGH gMF-1 h-1) Controle Inóculo A Inóculo B (a) 5 4 (b) a a a a a a 3 2 1 0 IACSP94-2094 IACSP95-5000 Figura 7 – Atividade das enzimas redutase do nitrato (a) e sintetase da gutamina (b) dos genótipos IACSP94-2094 e IACSP95-5000 tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle). Letras distintas indicam diferenças significativas entre os tratamentos bacterianos dentro do genótipo pelo teste de Tukey (p<0,05). 4.2 Atenuação dos efeitos da restrição hídrica pela interação com bactérias diazotróficas endofíticas 4.2.1 Contagem de bactérias diazotróficas endofíticas A contagem realizada nas raízes no final do experimento revelou, em média, maior presença de bactérias nas plantas tratadas com os inóculos do que em plantas controle (Tabela 3). Quanto à presença de bactérias em diferentes condições hídricas, foi encontrado maior número em condição hidratada (H) do que em restrição hídrica (RH) no genótipo IACSP942094 (Tabela 3). Já para o genótipo IACSP95-5000, o número de bactérias em plantas sob RH foi maior do que H, tendo dobrado no tratamento com inóculo A (Tabela 3). 33 Tabela 3 - Número de bactérias (UFC 105 g-1) nas raízes dos genótipos IACSP94-2094 e IACSP95-5000 mantidos em condição hidratada (H) ou restrição hídrica (RH), tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle), em três meios de cultura (JNFb, LGIP, JMV). Contagem realizada no final do segundo experimento. Genótipos Tratamento JMV LGIP JNFb Meios de Cultura Média JMV LGIP Condições hídricas H JNFb Média RH IACSP94- Controle 2,0 45,0 3,0 16,7 0,4 4,0 0,9 1,7 2094 Inóculo A 45,0 45,0 110,0 66,7 1,4 25,0 25,0 25,7 Inóculo B 4,5 110,0 110,0 74,8 25,0 4,0 15,0 14,7 IACSP95- Controle 2,0 4,5 3,0 3,2 2,5 2,0 0,4 4,9 5000 Inóculo A 9,5 9,5 15,0 11,3 3,0 20,0 45,0 22,7 Inóculo B 4,5 9,5 2,0 5,3 2,0 25,0 0,9 9,3 Os valores são descritivos, não foi aplicado teste estatístico. 4.2.2 Altura e número de folhas Plantas dos dois genótipos tratadas com inóculos bacterianos não apresentaram altura ou número de folhas diferentes das plantas controle. Também não foram registradas diferenças entre plantas cultivadas e hidratadas (H) ou em restrição hídrica (NH). A altura média das plantas IACSP94-2094 foi de 44,9 cm em H e 45,2 cm em NH. Para IACSP95-5000, a média foi de 30,6 cm para H e 28,7 cm para NH. O número médio de folhas foi 7,0 nos dois genótipos. 4.2.3 Massa de matéria seca da parte aérea e das raízes Quanto à massa de matéria seca da parte aérea não foi possível verificar diferenças no crescimento em plantas tratadas com inóculos (Figura 8a,b) em relação ao controle. Para plantas do genótipo IACSP94-2094 não se observaram diferenças estatísticas entre plantas H e sob RH (Figura 8a) e no IACSP95-5000 essa diferença ocorreu entre o tratamento controle e o inóculo A, mas não nas plantas tratadas com o inóculo B (Figura 8b). A massa de matéria seca da raiz em plantas IACSP94-2094 não diferiu entre os tratamentos com inoculação ou controle, sendo que a única diferença encontrada foi na massa de matéria seca em plantas controle que foi maior em RH do que em H (Figura 8c). Plantas do 34 genótipo IACSP95-5000 tratadas com inóculo B sob RH apresentaram maior massa de matéria seca de raiz do que plantas H. Esse mesmo tratamento também foi maior do que o plantas controle e tratadas com o inóculo A (Figura 8d). IACSP95-5000 Massa de matéria seca de raiz (g) Massa de matéria seca da parte aérea (g) IACSP94-2094 A,a 18 (a) 16 A,a 14 12 10 8 6 4 2 0 Controle A,a A,a A,a A,a Inóculo A Inóculo B A,a A,a B,a Controle Inóculo A (d) A,a 20 B,a 15 A,a B,a 30 (c) 25 H RH (b) A,a A,a A,a A,a A,a A,b A,b A,a A,a Inóculo B A,a B,a 10 5 0 Controle Inóculo A Inóculo B Controle Inóculo A Inóculo B Figura 8 – Massa de matéria seca da parte aérea dos genótipos IACSP94-2094 (a,c) e IACSP95-5000 (b,d) tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle), mantidos hidratados (H) ou sob restrição hídrica (RH). Cada histograma representa o valor médio (n=5) ± desvio-padrão. Letras maiúsculas distintas indicam diferenças significativas entre condições hídricas dentro do mesmo tratamento bacteriano. Letras minúsculas distintas indicam diferenças significativas entre os tratamentos bacterianos dentro do mesmo genótipo pelo teste de Tukey (p<0,05). 4.2.4 Potencial hídrico e conteúdo relativo de água Plantas sob RH apresentaram potencial hídrico inferior ao das plantas hidratadas (H), exceto em IACSP94-2094 controle (Figura 9a). Plantas IACSP94-2094 tratadas com inóculo A ou B possuem valores de potenciais mais baixos que o controle quando RH, já em plantas IACSP95-5000, não foram verificadas diferenças entre plantas tratadas com inóculos e plantas controle. 35 IACSP95-5000 IACSP94-2094 0,0 Controle Inóculo A A,a A,a Inóculo B Controle Inóculo A Inóculo B -0,2 -0,4 Ψw (MPa) -0,6 -0,8 A,a A,a -1,0 -1,4 -1,6 A,a A,a -1,2 (a) A,a H RH B,b B,b (b) B,a B,a B,a Figura 9 – Potencial da água na folha (MPa) medido às 12h 30 min. nos genótipos de canade-açúcar IACSP94-2094 (a) e IACSP95-5000 (b) tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle), mantidos hidratados (H) ou em restrição hídrica (RH). Cada histograma representa o valor médio (n=3) ± desvio-padrão. Letras maiúsculas distintas indicam diferenças significativas entre condições hídricas dentro do mesmo tratamento bacteriano. Letras minúsculas distintas indicam diferenças significativas entre os tratamentos bacterianos dentro da mesma condição hídrica pelo teste de Tukey (p<0,05). O conteúdo relativo de água (CRA) não apresentou diferenças estatísticas entre plantas tratadas com inóculos (A ou B) e plantas controle em condição H ou sob RH. Plantas hidratadas apresentaram maior CRA do que plantas sob restrição em ambos os genótipos, exceto para plantas IACSP94-2094 controle (Figura 10). 4.2.5 Teores de prolina e de aminoácidos livres totais (ALT) Plantas IACSP95-5000 tratadas com o inóculo A apresentaram maior teor de prolina do que o controle em RH (Figura 11b). Plantas IACSP94-2094 tratadas com inóculo A ou B tiveram maiores teores de prolina quando em RH enquanto essa diferença não foi notada em plantas controle. 36 IACSP94-2094 100 (a) A,a A,a (b) A,a A,a A,a B,a B,a B,a Controle Inóculo A Inóculo B Controle Inóculo A B,a 80 CRA (%) A,a A,a H RH IACSP95-5000 B,a 60 40 20 0 Inóculo B Figura 10 – Conteúdo relativo de água nos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 (a) e IACSP95-5000 (b) tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle), mantidos hidratados (H) ou sob restrição hídrica (RH). Cada histograma representa o valor médio (n=5) ± desvio-padrão. Letras maiúsculas distintas indicam diferenças significativas entre condições hídricas dentro do mesmo tratamento bacteriano. Letras minúsculas iguais indicam ausência de diferenças significativas entre os tratamentos bacterianos dentro da mesma condição hídrica pelo teste de Tukey (p>0,05). IACSP94-2094 0,7 IACSP95-5000 (a) H RH Prolina [µmol (g MS)-1] 0,6 A,a A,ab A,a 0,5 0,4 (b) A,b A,a A,ab A,b 0,3 B,a B,a Inóculo A Inóculo B B,b 0,2 B,b B,b Inóculo A Inóculo B 0,1 0,0 Controle Controle Figura 11 – Teores de prolina nos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 (a) e IACSP95-5000 (b) tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle), mantidos hidratados (H) ou sob restrição hídrica (RH). Cada histograma representa o valor médio (n=3) ± desvio-padrão. Letras maiúsculas distintas indicam diferenças significativas entre condições hídricas dentro do mesmo tratamento bacteriano. Letras minúsculas distintas indicam diferenças significativas entre os tratamentos bacterianos dentro da mesma condição hídrica pelo teste de Tukey (p<0,05). 37 As plantas de IACSP94-2094 sob restrição hídrica e tratadas com inóculo A apresentaram maior quantidade ALT nas folhas que o controle (Figura 14a), enquanto que para IACSP95-5000, as plantas tratadas com inóculo B foram as que apresentaram maiores valores de ALT sob restrição hídrica (Figura 14b). 5,0 4,5 IACSP94-2094 IACSP95-5000 (a) A,a H (b) RH ALT [mg(g MS-1)] 4,0 3,5 A,a 3,0 A,b 2,5 2,0 B,a A,ab A,a A,a A,b B,a 1,5 A,b B,b B,ab Inóculo A Inóculo B 1,0 0,5 0,0 Controle Inóculo A Inóculo B Controle Figura 12 – Teores de aminoácidos livres totais (ALT) nos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 (a) e IACSP95-5000 (b) tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle) mantidos hidratados (H) ou sob restrição hídrica (RH). Cada histograma representa o valor médio (n=4) ± desvio-padrão. Letras maiúsculas distintas indicam diferenças significativas entre condições hídricas dentro do mesmo tratamento bacteriano. Letras minúsculas distintas indicam diferenças significativas entre os tratamentos bacterianos dentro da mesma condição hídrica pelo teste de Tukey (p<0,05). 4.2.6 Atividade fotoquímica Plantas IACSP95-5000 em RH apresentaram diminuição da eficiência quântica potencial (F V /F M ), sendo a média para plantas hidratadas 0,766 ± 0,016 e para plantas sob RH de 0,682 ± 0,028. Os valores de transporte aparente de elétrons (ETR) também foram menores em plantas sob RH, 71,11 ± 12,79 µmol m-2 s-1 em relação a plantas hidratadas 117,86 ± 9,31 µmol m-2 s-1. O coeficiente de extinção não fotoquímica da fluorescência (NPQ) aumentou em plantas sob RH (1,95±0,29) em relação a plantas hidratadas (1,44 ± 0,13). 4.2.7 Clorofila total 38 Plantas IACSP94-2094 tratadas com inóculo A tiveram diminuição da clorofila total quando em RH. Para a condição H, o tratamento com inóculo B também apresentou menos clorofila total que os demais tratamentos (Tabela 4). As plantas IACSP95-5000 foram mais influenciadas pelo tratamento com os inóculos, principalmente sob restrição hídrica, tendo valores de clorofila superiores às plantas controle. Em condição H, plantas tratadas com inóculo B apresentaram os maiores valores dentre os tratamentos (Tabela 4). Tabela 4 – Clorofila total nos dois genótipos de cana-de-açúcar mantidos hidratados (H) ou sob restrição hídrica (RH) tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculo A e B) ou não (controle). IACSP94-2094 Tratamentos Controle Inóculo A Inóculo B H 49,9 ± 1,1 A,a 50,3 ± 0,7 A,a 44,6 ± 1,0 A,b RH 49,9 ± 1,7 A,a 45,9 ± 2,1 B,a 46,6 ± 1,8 A,a IACSP95-5000 H 50,3 ± 2,5 A,b 52,6 ± 2,5 A,ab 54,8 ± 1,7 A,a RH 45,5 ± 2,3 B,b 52,4 ± 1,5 A,a 50,8 ± 3,5 B,a Letras maiúsculas distintas indicam diferenças entre condições hídricas dentro do mesmo tratamento bacteriano. Letras minúsculas distintas indicam diferenças entre os tratamentos bacterianos dentro da mesma condição hídrica e período. Tukey (p<0,05). Valor médio (n=4) ± desvio-padrão. 4.2.8 Trocas gasosas As plantas hidratadas tratadas com inóculo A apresentaram maior fotossíntese do que os demais tratamentos (controle, inóculo B) para os dois genótipos, em condições H (Figura 13a,b). Já em condições restritivas (RH), plantas IACSP94-2094 tratadas com inóculo A apresentaram os menores valores de fotossíntese (Figura 13a), e para IACSP95-5000 não foram encontradas diferenças estatísticas (Figura 13b). Assim como na fotossíntese, plantas dos dois genótipos tratadas com inóculo A apresentaram maiores valores de condutância (g s ) do que os outros tratamentos em condição H (Figura 13c,d). Em condições restritivas (RH) não foram encontradas diferenças entre os tratamentos bacterianos (inóculo A, B ou controle), mas as plantas apresentaram menor condutância do que plantas H (Figura 13c,d). Quanto à concentração intercelular de CO 2 , plantas IACSP94-2094 em RH tratadas com inóculo A ou B apresentaram maiores valores de C i em relação ao controle e em relação a plantas tratadas com inóculos e hidratadas (H) (Figura 13e). Plantas IACSP95-5000 em RH apresentaram maiores valores de Ci quando tratadas com inóculo A (Figura 13f). 39 IACSP94-2094 gs (mol m-2 s-1) A (µmol m-2 s-1) 40 35 (a) 30 25 20 A,b B,a 15 10 5 0 Controle 0,30 (c) 0,25 0,20 (b) A,b B,a B,a Inóculo A Inóculo B Controle Inóculo A Inóculo B A,a A,b A,b A,b B,a B,a B,a B,a Controle B,a (d) Inóculo A Inóculo B 300 (e) 250 B,a B,a Controle Inóculo A Inóculo B (f) A,a A,a A,a 200 A,a 150 A,a 100 B,a B,b 0,05 Ci (µmol mol-1) A,b A,b A,a 0,10 H RH A,a 0,15 A,ab 0,00 IACSP95-5000 A,a B,a B,a A,b B,b B,b A,a B,c 50 0 Controle Inóculo A Inóculo B Controle Inóculo A Inóculo B Figura 13 – Assimilação de CO 2 (A-a,b), condutância estomática (gs-c,d), concentração intercelular de CO 2 (Ci-e,f) de plantas dos genótipos IACSP94-2094 (a,c,e) e IACSP95-5000 (b,d,f) tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle), mantido hidratados (H) ou sob restrição hídrica (RH) medidos às 13 horas. Cada histograma representa o valor médio (n=3) ± desvio-padrão. Letras maiúsculas distintas indicam diferenças significativas entre condições hídricas dentro do mesmo tratamento bacteriano e genótipo. Letras minúsculas distintas indicam diferenças significativas entre os tratamentos bacterianos dentro da mesma condição hídrica e genótipo pelo teste de Tukey (p<0,05). 40 Plantas IACSP94-2094 com inóculo apresentaram menor transpiração sob restrição E (mmol m-2 s-1) hídrica do que as plantas sem inóculo (Figura 14a). IACSP94-2094 IACSP95-5000 5,0 (a) (b) A,a H 4,5 RH 4,0 A,a A,a 3,5 A,a A,a A,a 3,0 A,a 2,5 B,a 2,0 B,a B,a B,a B,a 1,5 1,0 0,5 0,0 Controle Inóculo A Inóculo B Controle Inóculo A Inóculo B Figura 14 – Transpiração (E) de plantas dos genótipos IACSP94-2094 (a) e IACSP95-5000 (b) tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle) mantidos hidratados (H) ou sob restrição hídrica (RH) medida às 13 horas. Cada histograma representa o valor médio (n=3) ± desvio-padrão. Letras maiúsculas distintas indicam diferenças significativas entre condições hídricas dentro do mesmo tratamento bacteriano e genótipo. Letras minúsculas iguais indicam ausência de diferenças significativas entre os tratamentos bacterianos dentro da mesma condição hídrica e genótipo pelo teste de Tukey (p<0,05). Plantas IACSP94-2094 em RH respiraram menos quando tratadas com inóculo A e quando hidratadas (H) respiraram mais do que em RH. Já as tratadas com inóculo B, respiraram mais em restrição hídrica do que em condições de boa disponibilidade hídrica (Tabela 5). O genótipo IACSP95-5000 quando tratado com inóculo A apresentou menores valores de respiração, tanto em condições H como em RH (Tabela 5). 41 Tabela 5 – Respiração nos dois genótipos de cana-de-açúcar mantidos hidratados (H) ou sob restrição hídrica (RH) tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle). IACSP94-2094 H IACSP95-5000 RH H RH -2 -1 Controle Inóculo A Inóculo B 1,21 ± 0,17Aab 1,27 ± 0,41Aa 0,79 ± 0,09Bb (µmol m s ) 1,27 ± 0,16Aa 1,10 ± 0,23Aa 0,89 ± 0,17Bb 0,61 ± 0,18Ab 1,98 ± 0,57Aa 0,96 ± 0,17Aab 1,30 ± 0,29Aa 0,71 ± 0,07Ab 0,87 ± 0,09Aab Letras maiúsculas distintas indicam diferenças entre condições hídricas dentro do mesmo tratamento bacteriano. Letras minúsculas distintas indicam diferenças entre os tratamentos bacterianos dentro da mesma condição hídrica e período. Tukey (p<0,05). Valor médio (n=4) ± desvio-padrão. 4.2.9 Carboidratos O teor de AST aumentou em condições de RH para os dois genótipos (Figura 15a,b). Em condições hidratadas (H), plantas IACSP94-2094 tratadas com inóculo A apresentaram maiores teores de AST do que plantas controle (Figura 15a). AST [mg Glu (g MS-1)] H RH (b) A,a A,a A,a 140 IACSP95-5000 IACSP94-2094 180 (a) 160 A,a A,a A,a 120 100 80 B,a B,ab B,b B,a B,a B,a Controle Inóculo A 60 40 20 0 Controle Inóculo A Inóculo B Inóculo B Figura 15 – Teores de açúcares solúveis totais (AST) nos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 (a) e IACSP95-5000 (b) tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle) mantidos hidratados (H) ou sob restrição hídrica (RH). Cada histograma representa o valor médio (n=4) ± desvio-padrão. Letras maiúsculas distintas indicam diferenças significativas entre condições hídricas dentro do mesmo tratamento bacteriano. Letras minúsculas distintas indicam diferenças significativas entre os tratamentos bacterianos dentro da mesma condição hídrica pelo teste de Tukey (p<0,05). 42 Os teores de Sac em plantas IACSP94-2094 foram maiores em RH do que H para plantas controle e tratadas com inóculo A, enquanto que para o tratamento com inóculo B essa diferença não foi encontrada (Figura 16a). O genótipo IACSP95-5000 não apresentou diferença estatistica no teor de sacarose (Figura 16b). IACSP94-2094 70 (a) 60 SAC [mg Suc (g MS)-1] IACSP95-5000 A,ab A,a 50 A,a A,b 40 30 H RH (b) B,b B,b Controle Inóculo A A,a A,a A,a A,a A,a A,a Controle Inóculo A Inóculo B 20 10 0 Inóculo B Figura 16 – Teor de sacarose (SAC) nos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 (a) e IACSP95-5000 (b) tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle) mantidos hidratados (H) ou sob restrição hídrica (RH). Cada histograma representa o valor médio (n=4) ± desvio-padrão. Letras maiúsculas distintas indicam diferenças significativas entre condições hídricas dentro do mesmo tratamento bacteriano. Letras minúsculas distintas indicam diferenças significativas entre os tratamentos bacterianos dentro da mesma condição hídrica pelo teste de Tukey (p<0,05). Plantas IACSP94-2094 tratadas com inóculos possuem menores teores de AMI do que plantas controle (Figura 17a). Plantas desse genótipo tratadas com inóculo B em RH foram as que apresentaram menores teores de AMI em relação aos controles e em relação à condição hidratada (Figura 17a). Plantas IACSP95-5000 apresentaram maiores teores de AMI quando tratadas com inóculo A quando hidratadas e em RH (Figura 17b). As plantas IACSP95-5000 tratadas com inóculo B apresentaram diferença em relação à condição hidratada (Figura 17b). 43 35 AMI [mg Glu (g MS)-1] (b) (a) 30 25 IASP95-5000 IACSP94-2094 H RH A,a B,a A,ab A,b 20 A,b A,a B,c A,b A,a A,b A,ab B,ab 15 10 5 0 Controle Inóculo A Inóculo B Controle Inóculo A Inóculo B Figura 17 – Teores de amido (AMI) nos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 (a) e IAC95-5000 (b) tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle) mantidos hidratados (H) ou sob restrição hídrica (RH). Cada histograma representa o valor médio (n=4) ± desvio-padrão. Letras maiúsculas distintas indicam diferenças significativas entre condições hídricas dentro do mesmo tratamento bacteriano. Letras minúsculas distintas indicam diferenças significativas entre os tratamentos bacterianos dentro da mesma condição hídrica pelo teste de Tukey (p<0,05). 4.2.10 Nitrogênio Não houve diferenças estatísticas entre os tratamentos com inóculos e controle, nem entre as condições hídricas (H e RH) em relação aos teores de nitrogênio (Tabela 6). Tabela 6 – Teores de nitrogênio (g kg -1) nos dois genótipos de cana-de-açúcar IACSP942094 e IACSP95-5000 tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle), mantidos hidratados (H) ou sob restrição hídrica (RH). IACSP94-2094 Controle Inóculo A Inóculo B H 21,3 ± 0,9ns 22,9 ± 1,8 21,1 ± 0,9 IACSP95-5000 Condições hídricas RH H RH ns ns 19,1 ± 1,9 21,6 ± 1,5 20,4 ± 0,9ns 20,7 ± 1,6 20,6 ± 0,6 19,5 ± 0,7 21,0 ± 0,8 20,4 ± 1,3 19,2 ± 0,3 ns indica diferenças não significativas pelo teste de Tukey (p<0,05). Valores referem-se às médias (n=5) ± desvios-padrão. 44 O genótipo IACSP94-2094 tratado com inóculo B apresentou maior acúmulo de nitrogênio em RH do que em H (Tabela 7). Plantas IACSP95-5000 tratadas com inóculo B apresentaram maiores valores de nitrogênio acumulado do que plantas controle ou tratadas com inóculo A quando em RH (Tabela7). Quanto ao índice de eficiência de utilização de nitrogênio, plantas IACSP95-5000 tratadas com inóculo B em RH tiveram maior eficiência na conversão do N fixado ou absorvido (Tabela 8 – destaque). 4.2.11 Atividade de enzimas do metabolismo do nitrogênio A atividade da RN em plantas IACSP94-2094 sob RH foi maior em plantas tratadas com o inóculo B (Figura 19a). Em plantas IACSP95-5000 sob RH a maior atividade foi verificada no tratamento com inóculo A e a menor com inóculo B (Figura 18b). Plantas hidratadas (H) tratadas com inóculo B apresentaram maior atividade da RN (Figura 18b). IACSP94-2094 Atividade da RN (nmol de NO2 g MF-1 h-1) 25 IACSP95-5000 (a) A,a (b) H RH 20 15 10 A,a A,a B,b A,b A,b B,b A,b B,c 5 0 A,a A,ab controle Inóculo A Inóculo B controle Inóculo A B,b Inóculo B Figura 18 – Atividade da redutase do nitrato (RN) nos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 (a) e IACSP95-5000 (b) tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle) mantidos hidratados (H) ou sob restrição hídrica (RH). Cada histograma representa o valor médio (n=3) ± desvio-padrão. Letras maiúsculas distintas indicam diferenças significativas entre condições hídricas dentro do mesmo tratamento bacteriano. Letras minúsculas distintas indicam diferenças significativas entre os tratamentos bacterianos dentro da mesma condição hídrica pelo teste de Tukey (p<0,05). 45 Tabela 7 – Quantidade de nitrogênio acumulado (mg N planta-1) nos dois genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP95-5000 tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle), mantidos hidratados (H) ou sob restrição hídrica (RH). IACSP94-2094 Controle Inóculo A Inóculo B H 250,45 ±14,68 A b 335,16 ± 30,85 A a 249,31 ± 4,70 B b IACSP95-5000 Condições hídricas RH H 262,53 ± 8,78 A a 262,10 ± 13,59 A a 277,00 ± 10,90 A a 252,01 ± 5,43 A ab 308,72 ± 9,57 A a 231,80 ± 1,09 A b RH 182,65 ± 9,70 B b 194,37 ± 17,10 B ab 216,31 ± 10,12 A a Valores médios (n=3) ± desvios-padrão. Letras maiúsculas distintas indicam diferenças entre condições hídricas dentro do mesmo tratamento bacteriano. Letras minúsculas distintas indicam diferenças entre tratamentos bacterianos dentro da mesma condição hídrica pelo teste de Tukey (p<0,05). Tabela 8 – Índice de eficiência de utilização de nitrogênio (g biomassa2/g nutriente-1) nos dois genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP95-5000 tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle), mantidos hidratados (H) ou sob restrição hídrica (RH). IACSP94-2094 Controle Inóculo A Inóculo B H 0,508 ± 0,070 B a 0,481 ± 0,066 A a 0,575 ± 0,025 B a IACSP95-5000 Condições hídricas RH H 0,697 ± 0,096 A a 0,596 ± 0,027 A a 0,480 ± 0,010 A b 0,605 ± 0,015 A a 0,700 ± 0,031 A a 0,581 ± 0,067 A a RH 0,459 ± 0,036 B b 0,538 ± 0,046 A ab 0,587 ± 0,027 A a Valores médios (n=3) ± desvios-padrão. Letras maiúsculas distintas indicam diferenças entre condições hídricas dentro do mesmo tratamento bacteriano. Letras minúsculas distintas indicam diferenças entre tratamentos bacterianos dentro da mesma condição hídrica pelo teste de Tukey (p<0,05). 46 Em plantas IACSP94-2094 em RH, a sintetase da glutamina teve maior atividade quando tratadas com inóculo A e em H não apresentou diferença estatística (Figura 19a). Já para plantas IACSP95-5000 em RH, não ocorreram diferenças estatísticas entre os tratamentos, enquanto que H a maior atividade de SG foi registrada em plantas tratadas com o inóculo B (Figura 19b). IACSP94-2094 14 H RH (a) Atividade SG (µmol de GGH g MF-1 h-1) 12 (b) A,a A,a 10 8 IACSP95-5000 A,a A,ab A,a A,a A,b A,b A,a B,a 6 A,a A,b 4 2 0 Controle Inóculo A Inóculo B Controle Inóculo A Inóculo B Figura 19 – Atividade da sintetase da glutamina (SG) nos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP95-5000 tratados com bactérias endofíticas diazotróficas (inóculos A e B) ou não (controle) mantidos hidratados (H) ou sob restrição hídrica (RH). Cada histograma representa o valor médio (n=3) ± desvio padrão. Letras maiúsculas distintas indicam diferenças significativas entre condições hídricas dentro do mesmo tratamento bacteriano. Letras minúsculas distintas indicam diferenças significativas entre os tratamentos bacterianos dentro da mesma condição hídrica pelo teste de Tukey (p<0,05). 5 DISCUSSÃO 5.1 Efeitos da interação planta-bactéria na fisiologia de cana-de-açúcar A contagem de bactérias nos colmos indicou a presença desses organismos nos tecidos de cana-de-açúcar, com maior concentração no genótipo IACSP95-5000 (Tabela 1). Além das bactérias nativas do tecido, foram feitas as três inoculações, objetivando que as bactérias selecionadas se sobrepusessem às nativas. Mesmo com maior número de bactérias nativas no genótipo IACSP95-5000 e as inoculações com bactérias selecionadas, não foi observada 47 promoção de crescimento. Plantas tratadas com os inóculos não tiveram maior massa seca de parte aérea ou raiz (Figura 1) do que as plantas controle, sendo que a altura e o número de folhas também não diferiram. Um dos resultados mais enfatizados na literatura em relação ao uso de bactérias como inoculante é a promoção de crescimento (RYAN et al., 2008), com estímulo no desenvolvimento tanto da parte aérea como das raízes (OLIVEIRA et al., 2002). Tanto pelo referencial teórico do uso desse grupo de bactérias como pelos resultados obtidos por FREITAS (2011), do qual foram selecionados os isolados para composição dos inoculos usados, o resultado esperado não foi observado, ou seja, maior crescimento das plantas tratadas com os inóculos em relação ao controle. Apesar disto, a interação entre planta e bactérias causou um estímulo na assimilação de CO 2 (Figura 5a). O aumento da fotossíntese no genótipo IACSP95-5000 tratado com inóculo A pode estar ligado ao aumento da abertura estomática (Figura 5b). O aumento da condutância estomática pode ter sido estimulado por sinais hormonais enviados pelas bactérias, tendo como conseqüência a maior disponibilidade de CO 2 para plantas tratadas com o inóculo A. Já para IACSP94-2094 tratado com inóculo B, o estímulo da fotossíntese pode estar ligada ao aumento do ETR (Figura 4a), pois o transporte aparente de elétrons gera moléculas energéticas, ATP e NADPH, que são usadas na assimilação de carbono. No entanto, a maior fotossíntese não resultou no aumento da matéria seca das plantas tratadas. O estímulo da fotossíntese proporcionou aumento na disponibilidade de carboidratos nas plantas IACSP94-2094 quando tratadas com inóculo B (Figura 6). O maior teor de sacarose nessas plantas provavelmente é resultado da maior fotossíntese, indicando um efeito direto da presença das bactérias endofíticas na fisiologia. No entanto, para plantas IACSP955000 tratadas com inóculo A, condição que estimulou a fotossíntese, não houve maiores teores de carboidratos e as tratadas com inóculo B apresentam valores de SAC menores que o controle (Figura 6a). A diminuição de SAC, um açúcar solúvel, não resultou em menores teores AST nesse caso, podendo-se pensar na hipótese de que deve haver outro açúcar solúvel sendo produzido, por exemplo, a frutose, como o encontrado em maiores concentrações em plantas tratadas com bactérias endofíticas no trabalho de SHI et al. (2010). A SAC poderia estar sendo consumida pela planta com sua quebra e utilização de açúcar para a respiração, mas os valores de respiração não apresentam diferenças entre os tratamentos. Se as plantas do genótipo produtivo não se utilizam do carboidrato produzido pelo estímulo da fotossíntese, algum desvio deve ocorrer. Segundo FUENTES-RAMÍREZ et al. (1999), uma diminuição da sacarose pode estar relacionada ao seu uso pelas bactérias fixadoras de nitrogênio que colonizam a planta. A fonte 48 de carbono forneceria energia para o estabelecimento dessa relação entre planta e bactéria. Essa poderia ser uma explicação para os baixos níveis de sacarose em plantas IACSP95-5000 (Figura 6a). Pode-se traçar um paralelo com outra forma de interação: planta-rizóbio. Nessa interação, os bacteróides presentes nos nódulos, por necessitarem de muita energia para a fixação de nitrogênio, acabam por ser um dreno de carboidratos, o que estimula a fotossíntese, ocorrendo uma maior conversão de triose-P para sacarose, que é transportada para os drenos (KASCHUK et al., 2009). Outra alteração fisiológica registrada foi o aumento da atividade da redutase do nitrato (RN) em plantas IACSP95-5000 tratadas com inóculo A e B, este último com maior atividade (Figura 7b). A RN está ligada com a redução de nitrato a nitrito, que é transformado posteriormente em amônio, e em sequência assimilado em glutamina pela sintetase da glutamina (SG). Neste experimento, SG não teve aumento de atividade, não sendo então o nitrito produzido pela RN das plantas IACSP95-5000 tratadas com inóculos A e B utilizado pela SG na folha. Os teores de nitrogênio e de ALT também não foram alterados, indicando que o nitrato poderia não estar sendo utilizado pelas plantas. DONATO et al. (2004) indicam que a influência de bactérias no metabolismo de nitrogênio estaria no aumento da atividade da RN, aumentando a entrada de nitrato e, consequentemente, favorecendo aumento nos teores de nitrogênio na planta. Então, as plantas deste trabalho que apresentaram maior atividade de RN deveriam ser favorecidas, fato que não ocorreu. O teor de prolina também não aumentou em plantas tratadas com os inóculos, pelo contrário, os maiores teores foram observados em plantas controle (Figura 3). Esse aminoácido tem sido relacionado à proteção das plantas a diferentes estresses (ASHRAF & FOOLAD, 2007), mas neste experimento, as plantas encontravam-se em condições de adequada disponibilidade hídrica, o que não justificaria um aumento da produção de prolina em plantas controle, mas talvez um consumo desse aminoácido em plantas tratadas. Além do mais, os teores de prolina encontrados são muito baixos para terem função de proteção. Em SARAVANAKUMAR et al. (2011), os valores de prolina de plantas de Vignia radiata tratadas com bactérias aumentou 3 vezes da condição bem irrigada para condição de estresse hídrico. Quanto à caracterização hídrica das plantas, foi observado que plantas tratadas com inóculos tiveram potencial hídrico maior do que plantas controle (Figura 2). Como todas as plantas estavam sob adequada disponibilidade hídrica, as alterações registradas devem ter sido provocadas pela interação com os inóculos. CREUS et al. (2004) relatam que, independente 49 de estresse hídrico, a fração de água no apoplasto aumenta em resposta a inoculação com Azospirillum, o que pode justificar esse aumento no potencial hídrico de plantas tratadas. A análise dos dados pelo gráfico radar (Figura 21) indica os principais parâmetros que são influenciados pela inoculação de bactérias endofíticas em relação às plantas controle. Para o genótipo IACSP94-2094, o tratamento com o inóculo B tem um maior número de parâmetros influenciados, sendo A, ETR e prolina os principais (Figura 21a). Para o genótipo IACSP95-5000, os dois inóculos influenciaram os parâmetros medidos. Plantas tratadas com o inóculo A se diferenciaram estatisticamente do controle em A e gs, Ψw, RN, e prolina. Para plantas tratadas com inóculo B, os parâmetros que mais se diferenciam do controle são Ψw, Sac e RN (Figura 21b). IACSP94-2094 (a) MSPA 2,5 ALT * IACSP95-5000 (b) MSPA 2,5 ALT MSR A* Prolina * Prolina A 1,0 1,0 GS GS gs * gs 0,5 0,5 0,0 0,0 RN * RN E Ntotal ETR AST * ψw E Ntotal ETR AST NPQ * * 1,5 1,5 Sac MSR 2,0 2,0 * Inóculo A * NPQ * Controle * Sac ψw * Inóculo B Figura 20 – Representação das respostas fisiológicas dos genótipos IACSP94-2094 (a) e IACSP95-5000 (b) com boa disponibilidade hídrica, tratados com inóculo A (quadrado) e inóculo B (triangulo) em relação aos respectivos controles (linha pontilhada). Os valores referem-se a mudanças relativas das seguintes variáveis: massa de matéria seca da parte aérea (MSPA), massa seca de raiz (MSR), fotossíntese (A), condutância estomática (gs), transpiração (E), transporte aparente de elétrons (ETR), coeficiente de extinção fotoquímica (NPQ), potencial hídrico (Ψw), teor de sacarose (Sac), teor de açúcares solúveis totais (AST), teor de nitrogênio (N), atividade da redutase do nitrato (RN), atividade da sintetase da glutamina (SG), teor de prolina (Prolina), teor de aminoácidos livres totais (ALT). * indicam diferença estatística em relação ao controle. HARDOIM et al. (2008) sugerem um novo conceito: endofíticos competentes. Seriam microrganismos que colonizam a planta com sucesso, entrando nos seus tecidos, e apresentam 50 capacidade de modular a fisiologia da planta a ser favorecida, levando à manutenção dos benefícios da associação. Foram observadas mudanças benéficas na fisiologia dos dois genótipos, no entanto, não houve alterações no crescimento vegetal. O estímulo à fotossíntese e à atividade da redutase do nitrato deveria garantir maiores valores de matéria seca ou maiores teores de nitrogênio. Se a influência na fisiologia da planta não é benéfica, seria a bactéria a mais beneficiada nessa interação? O carboidrato fixado e o nitrogênio (nitrito – produto da RN e a prolina) poderiam ser utilizados para o consumo da comunidade bacteriana no interior dos tecidos vegetais. Como as plantas não estavam sob estresse, o excedente desses compostos não poderiam estar sendo usados para manutenção do metabolismo vegetal, fato corroborado pela não alteração dos valores de respiração. Além disso, não há explicação plausível que justifique um aumento do metabolismo do C e do N sem que os produtos fossem utilizados. Talvez a interação da planta com as bactérias inoculadas não tenha sido suficientemente eficiente para se encaixar no conceito de endofíticos competentes, visto que a promoção de crescimento não ocorreu (Figuras 1), apesar de outras alterações fisiológicas observadas. As alterações fisiológicas poderiam ser destinadas à manutenção dos organismos endofíticos. 5.2 Atenuações dos efeitos do estresse hídrico por bactérias endofíticas diazotróficas Pela contagem de bactérias nas raízes (Tabela 3) pode-se afirmar que ocorreu colonização efetiva, já que as plantas que receberam inóculo (inóculo A ou B - bactérias introduzidas) mostraram um número superior ao das plantas que não receberam (controle – presença de bactérias nativas). Nas inoculações, usaram-se concentrações bacterianas comumente recomendadas (OLIVEIRA et al., 2002; CREUS et al., 2004), objetivando que as bactérias selecionadas se sobrepusessem às nativas. O número de bactérias nas raízes sofreu alteração dependente da condição hídrica (Tabela 3). Plantas do genótipo tolerante IACSP94-2094 apresentaram redução do número de bactérias em RH. Para COMPANT et al. (2010), as condições ambientais podem influenciar o número de bactérias presentes em condições de restrição hídrica, sendo a comunidade afetada pela seca. No entanto, essa influência negativa não ocorreu para plantas do genótipo sensível (IACSP95-5000). Pelo contrário, o número médio de bactérias presentes nas raízes das plantas em RH foi maior do que plantas hidratadas (H). Aparentemente, as plantas desse 51 genótipo favorecem as bactérias apenas em RH e resta saber se essa interação também traria benefícios para a planta que está sob condição hídrica restritiva. Outro aspecto a ser considerado é a reestruturação de características do solo pela introdução de microrganismos. O substrato autoclavado perdeu as características de um solo com microrganismos vivos, a introdução do inóculo pode ter favorecido a reestruturação de características como, por exemplo, solubilização de fosfatos e disponibilização de nutrientes para plantas, ou, até mesmo, o estabelecimento da comunidade rizosférica. Nos dois experimentos foram utilizados colmos não desinfestados que mantiveram os microrganismos nativos. Não se conhecia o hábito das bactérias nativas podendo ser endofíticas facultativas (podem viver fora de tecidos vegetais) ou rizosféricas, que também podem influenciar a fisiologia do vegetal. Pela complexidade da interação e presença de microrganismos nativos as respostas fisiológicas das plantas são muitas vezes difíceis de serem esclarecidas, já que o material controle também possui bactérias, mesmo que em menor quantidade, mas possíveis de influenciar a planta . Sob restrição hídrica, plantas do genótipo IACSP95-5000, sensíveis à seca (LANDELL et al., 2005b), quando tratadas com inóculo B não sofreram redução de massa de matéria seca da parte aérea e apresentaram maior massa de matéria seca de raiz (Figura 8b). Esses resultados mostram que o tratamento com inóculo B pode impedir a restrição de crescimento da parte aérea e ainda promover o crescimento na raiz em condições hídricas restritivas. Esta resposta pode ser respaldada pelo maior número de bactérias em plantas IACSP95-5000 em RH. Bactérias podem alterar o padrão de crescimento das plantas pela produção de fitormônios (TSAVKELOVA et al., 2006a), como o ácido 3,indol-acético (AIA) aumentar a produção de massa seca (SHI et al., 2010). Para o genótipo IACSP94-2094, tolerante à seca (LANDELL et al., 2005a; MACHADO et al., 2009), não ocorreu diminuição da matéria seca (Figura 8a), mas também não ocorreu promoção de crescimento pelas bactérias. Talvez, a interação com as bactérias seja mais eficiente em genótipos sensíveis à seca do que nos tolerantes. LIDDYCOAT et al. (2009) também observaram respostas diferentes dos genótipos de aspargos tratados com bactérias; um genótipo foi favorecido em condição hídrica ideal e o outro em restrição hídrica. Em trabalho com arroz usando rizobactérias osmotolerantes, YUWONO et al. (2005) observaram que os resultados mais pronunciados dos inóculos ocorreram em condições de restrição hídrica. A diminuição do crescimento das plantas IACSP95-5000 sob RH foi provavelmente resultado das modificações fisiológicas que ocorrem sob deficiência hídrica. Foram registrados menores potenciais hídricos foliares (Ψ w ) em condição de RH (Figura 9), que 52 podem causar alterações bioquímicas. Segundo PIMENTEL (2004), em estágio de deficiência moderada, em que a planta tem a transpiração reduzida (Figura 15), pode haver redução da atividade enzimática da redutase do nitrato, aumento de carboidratos solúveis e aminoácidos livres totais e prolina. No presente trabalho, ocorreu aumento de carboidratos (Figura 16 e 17), prolina (Figura 11) e ALT (Figura 12). O potencial hídrico sob RH em IACSP94-2094 foi menor em plantas tratadas com os inóculos do que no controle (Figura 9a), assim como o conteúdo relativo de água (CRA) que foi menor em plantas tratadas do que no controle (Figura 10a). O aumento da prolina poderia estar ligado a um aumento de compostos osmorreguladores, importantes em situações de estresse. Sugere-se que a prolina tenha relação com maior tolerância de cultivares de cana-deaçúcar à seca (INMAN-BAMBER & SMITH, 2005; MOLINARI et al., 2007). Os teores de prolina foram maiores em plantas sensíveis a seca, IACSP95-5000, tratadas com inóculo, principalmente inóculo A, confirmando a hipótese de que esse genótipo foi mais favorecido pelo tratamento bacteriano. No entanto, os valores de prolina encontrados são baixos e podem ser apenas indicativos de alterações metabólicas devido ao estresse e não a uma resposta adaptativa com efeitos protetores para planta (SOUZA et al., 2004). Outros compostos como a glicina-betaina poderiam ter sido produzidos pelas bactérias em resposta ao estresse aumentando a tolerância das plantas com menor potencial hídrico (DIMKPA et al., 2009). Neste trabalho, o teor de AST aumentou em plantas sob RH (Figura 16). O acúmulo de carboidratos também tem função osmoprotetora e de regulação osmótica (CHAVES et al., 2002 e NIEDZWIEDZ-SIEGIEN et al., 2004). Carboidratos devem ser acumulados de forma rápida e em quantidade suficiente para cumprir o seu papel de proteção, como por exemplo, a sacarose que protege membranas de cloroplastos e tonoplastos da dissecação (DINAKAR et al., 2012). Foi possível verificar aumento de SAC em plantas IACSP94-2094 (tolerantes à seca) tanto tratadas com inóculo A quanto no controle (Figura 17a). A quantidade de amido variou em função da condição hídrica apenas em IACSP94-2094 controle e inóculo B (Figura 18a). O amido, carboidrato de reserva, seria consumido e convertido em açúcares solúveis em condições de restrição hídrica como forma de proteção celular (LEE et al., 2008). Observaram-se maiores valores de amido em plantas IACSP94-2094 controle que nas plantas tratadas com inóculos, indicando que plantas tratadas necessitariam de mais energia para sua manutenção em condição de estresse, o que pode ter levado à maior degradação de AMI. Os teores de AMI em IACSP95-5000 tratados com inóculo B e em RH diminuem em relação à condição irrigada (Figura 18b), fato que pode estar relacionado a não diminuição de 53 crescimento. Plantas desse tratamento recorreriam à degradação de AMI para manutenção do metabolismo em situação de estresse. As alterações nos teores de carboidratos estão relacionadas à fotossíntese. A restrição hídrica leva à diminuição do potencial hídrico (Figura 9) reduzindo a assimilação de CO 2 (Figura 14a,b), que é intimamente associada ao fechamento estomático (Figura 14c,d) (CHAVES, 1991). A redução da assimilação de carbono em plantas sob RH acaba por levar a uma degradação de AMI elevando os teores de açúcares solúveis. A resposta das plantas à falta de água com o fechamento estomático foi verificada neste trabalho (Figura 14c,d) e apesar de não ter havido diferenças entre plantas tratadas com inóculos e controle, ainda assim a diminuição da condutância estomática revelou um padrão de resposta interessante. Isto é, nas plantas controle, a mudança da condição hidratada (H) para a restritiva (RH) ocasionou uma redução da condutância estomática de 35%, em média, para ambos os genótipos. Entretanto, para plantas IACSP94-2094, a redução na condutância foi de 69% nas plantas tratadas com inóculo A e de 39% nas com inóculo B, enquanto que nas plantas IACSP955000, a redução ficou em 78% e 60% para os inóculos A e B, respectivamente. Isso mostra que os tratamentos com inóculos influenciaram o fechamento estomático e de forma mais intensa no genótipo sensível (IACSP95-5000). O maior fechamento estomático pode ser um indicativo de envio de sinais químicos da raiz para a parte aérea (DAVIES & ZHANG, 1991) ou mesmo de substâncias osmorreguladoras que podem influenciar no fechamento estomático. Observou-se também que em condição hidratada (H) plantas de ambos os genótipos, tratadas com inóculo A, possuem maiores valores de fotossíntese (Figura 14a,b). Sugere-se que a fotossíntese de plantas tratadas com bactérias poderia ser estimulada pela melhor nutrição da planta ou ainda pela eliminação de limitações enzimáticas ou maior transporte de elétrons, além de estimular o consumo de triose fosfato da célula, garantindo fluxo de saída para os drenos (KASCHUK et al., 2009). SHI et al. (2010) registraram estímulo da fotossíntese por bactérias endofíticas em plantas com maior conteúdo de clorofila, maior F V /F M . Neste trabalho, os dados de clorofila total em plantas IACSP95-5000 tratadas com inóculo A corroboram essa hipótese de estímulo da fotossíntese por ter mais clorofila do que plantas controle (Tabela 4). No entanto, a maior quantidade de clorofila total não causou aumento na atividade fotoquímica. O estímulo à fotossíntese não garantiu promoção de crescimento às plantas tratadas com inóculo A e não explica o impedimento da restrição de crescimento em plantas IACSP95-5000 em RH tratadas com inóculo B. Nenhum demais parâmetros discutidos até agora parecem explicar esse favorecimento do genótipo sensível em condição restritiva. 54 Observou-se que as plantas do genótipo sensível apresentaram maiores teores de ALT quando em RH (Figura 12b) e a diferença ainda é maior quando sob o tratamento com inóculo B. A princípio, o aumento de ALT poderia estar ligado à proteólise devido à suscetibilidade à seca (ROY-MACAULEY et al., 1992). No entanto, o genótipo sensível tratado com inóculo B apresenta manutenção de crescimento sugerindo que o aumento de ALT poderia estar ligado à síntese de aminoácidos, fazendo com que o crescimento se mantenha. A atividade das enzimas redutase do nitrato e sintetase da glutamina não foram maiores quando o genótipo sensível tratado com inóculo B e, portanto, não explica a maior concentração de ALT. Mas, com o tratamento de bactérias endofíticas diazotróficas, o aumento de nitrogênio na planta pode ocorrer por maior estimulo na absorção de nitrogênio, inclusive aumentando a quantidade de proteínas nas plantas (SAUBIDET et al., 2002), o que poderia explicar a maior concentração de ALT. A eficiência do uso do nitrogênio de plantas do genótipo sensível tratadas com inóculo B é maior quando em condição de restrição hídrica (Tabela 8), o que coincide com o de ALT, indicando favorecimento dessas plantas sob esse tratamento bacteriano. 6 CONCLUSÕES Em condições de disponibilidade hídrica adequada, a interação planta-bactérias endofíticas influenciou positivamente as trocas gasosas e o metabolismo do nitrogênio dos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP95-5000, sem, entretanto, refletir em promoção de crescimento das plantas. O tratamento do genótipo de cana-de-açúcar sensível à seca com os isolados bacterianos que compuseram o inóculo B favoreceu a manutenção do crescimento das plantas, além de garantir melhor eficiência do uso do nitrogênio sob condições hídricas restritivas. 55 7 REFERÊNCIAS BIBIOGRÁFICAS AGUIAR, D. A.; SILVA, W. F.; RUDORFFI, B. F. T.; SUGAWARA, L. 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