genética molecular escolha de primers rapd com base na

GENÉTICA MOLECULAR
ESCOLHA DE PRIMERS RAPD COM BASE NA ANÁLISE COMPARATIVA ENTRE
DIFERENTES ESTIMADORES DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL
Thannya Nascimento Soares1, Lucileide Vilela Resende2, Mariana Pires de Campos Telles3 (orientadora)
[email protected], Flávia Melo Rodrigues4, José Alexandre Felizola Diniz Filho5, Rogério Pereira Bastos 6
1,2,3 – Laboratório de Biologia Molecular, Departamento de Zootecnia/UCG, Goiânia/GO; 4,5 e 6 – Departamento de
Biologia Geral/UFG, Goiânia/GO
Introdução: O desenvolvimento na capacidade computacional tem permitido grandes avanços no estabelecimento de
parâmetros genéticos obtidos através de marcadores moleculares Este trabalho teve como objetivo selecionar primers
que apresentassem melhor padrão de amplificação e maior variabilidade genética (i.e., número e distribuição de locos
polimórficos), bem como realizar uma análise inicial dos padrões de divergência populacional em Physalaemus
cuvieri. Para tanto foi realizada uma análise comparativa detalhada do padrão de devergência genética obtido para
cada primer RAPD através de diferentes estimadores. Essas informações são importantes para uma análise em
grande escala, pois maximiza a qualidade dos dados obtidos e minimiza o custo de sua obtenção.
Metodologia: Um total de 20 primers aleatórios foi amplificado utilizando a técnica de reação em cadeia da
polimerase (PCR), em 20 indivíduos de Physalaemus cuvieri das populações de Goianésia e Mara-Rosa, situadas no
Norte do Estado de Goiás. Os fragmentos amplificados foram separados pela técnica de eletroforese horizontal em
gel de agarose (1,5%), corados com brometo de etídio e fotografados. As análises foram realizadas para a matriz total
e para cada primer individualmente. Inicialmente, a variabilidade genética em cada população foi avaliada através da
diversidade de Nei. No caso do RAPD, assumiu-se equilíbrio de Hardy-Weinberg para estimar as freqüências. Além
disso, sob esse pressuposto, é possível desdobrar essa diversidade em seus componentes intra e interpopulacionais.
Uma outra maneira mais recente de estimar essa proporção de variação entre populações locais é a Análise de
Variância Molecular (AMOVA), que também desdobra em componentes intra e interpopulacionais. Neste estudo, foi
desenvolvido um programa em BASIC a fim de calcular o φST e GST, com base nos dados originais e com base em
diferentes subamostras destes, extraídas através da técnica de bootstrap.
Resultados: Os 10 primers selecionados apresentaram um total de 160 locos, dos quais 132 foram polimórficos na
população de Goianésia e 131 foram polimórficos na população de Mara Rosa. O número de locos variou entre 10 e
21 por primer. A diversidade de Nei (1973) média “dentro” das populações, considerando o total de locos, foi elevada
e igual a 0,2517, variando entre 0,1966 e 0,2809 para diferentes primers. A diversidade genética entre as populações
de Goianésia e Mara Rosa, calculada através do GST médio dos diferentes primers, foi relativamente baixa, igual a
0,064. Entretanto, a AMOVA mostrou um resultado um pouco diferente, com um φST igual a 0,094, calculado utilizando
todos os locos. Esse valor de φST foi estatisticamente diferente de zero ao nível de 0,0002 de probabilidade, indicando
assim uma divergência um pouco maior do que a estimada pelo GST. Nota-se que o valor do φST, para diferentes
primers, variou entre 0,017 e 0,196, o que indica que os primers analisados contêm diferentes informações sobre a
estrutura da variabilidade genética em seus locos. Os dois estimadores estão muito pouco correlacionados ao longo
dos primers (r = 0,139; P = 0,702). Outro ponto importante é que os valores de φST permanecem estáveis quando são
utilizados diferentes números de locos em sua estimativa. Replicando 1000 vezes a amostragem de locos pelo
procedimento de bootstrap observa-se que o φST médio permanece estável em torno de 9,5% e o coeficiente de
variação decresce exponencialmente com o aumento do número de locos Obviamente, estudos posteriores incluirão
um número maior de indivíduos, o que deve contra-balancear esse problema de estabilização.
Conclusão: A diferença entre esses estimadores pode ser, a princípio, explicada pelos pressupostos adotados em
seu cálculo. A AMOVA é mais adequada para o tipo de informação do marcador molecular utilizado (dados binários de
RAPD), de modo que seu resultado deve ser mais consistente. Por outro lado, o GST foi calculado assumindo
equilíbrio de HW para estimar as freqüências alélicas necessárias, e esse pressuposto necessariamente não pode ser
atendido. Além disso, as freqüências foram calculadas com um número muito reduzido de indivíduos, o que torna os
seus erros de estimativa muito elevados e, conseqüentemente, geram um erro acumulado no cálculo do GST. A queda
do coeficiente de variação com o aumento do número de locos mostra que, considerando esse valor relativamente
baixo de divergência entre populações e com poucos indivíduos analisados por população, um número relativamente
elevado de locos deve ser utilizado para que a divergência entre as populações seja detectada estatisticamente.
Agência Financiadora: Vice Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação da UCG; CNPq.
TRABALHO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA.
54ª Reunião Anual da SBPC – Goiânia – GO – Julho de 2002